Encimski imunski test krvnega seruma. Analiza HIV z ELISA: natančnost, zanesljivost. Zakaj je lahko rezultat nezanesljiv

Kako poteka študija ELISA?

Reakcijski mehanizem

Encimski imunski test temelji na imunski reakciji antigena s protitelesom in pritrditev encimske oznake na protitelesa omogoča, da se rezultat reakcije antigen-protitelo upošteva s pojavom encimske aktivnosti ali sprememba njegove ravni V poenostavljeni obliki lahko reakcijski mehanizem predstavimo na naslednji način:

Izračun rezultatov

Izvajanje encimskega imunskega testa

Za serodiagnozo se uporabljajo polistirenske plošče s 96 vdolbinicami, na stenah celic katerih je predhodno adsorbiran antigen. Testni serum se doda celici tablete. V tem primeru so nanj pritrjena protitelesa, homologna antigenu. Nepritrjena protitelesa se odstranijo z izpiranjem. Nato se celicam dodajo protitelesa proti človeškim imunoglobulinom (protitelesa), označena z encimom. Če so bila v testnem serumu prisotna zaznavna protitelesa, bodo na tej stopnji delovala kot antigeni, s katerimi bodo reagirala označena protitelesa. Dodatek kromogene snovi (barvila) po pranju nam bo omogočil, da upoštevamo reakcijo razvijajoče se barve v celicah. Intenzivnost barve je sorazmerna s količino encima in s tem količino protiteles.Pri merjenju optične gostote (OD) tekočine v celici in primerjavi s kontrolnim vzorcem se koncentracija protiteles izračuna v enotah. Najpogosteje se uporablja za izračun rezultatov v enotah optične gostote. Upoštevati je treba, da ima vsak testni sistem svoje indikatorje za beleženje rezultatov ter indikatorje normalnosti in patologije, ki jih je treba upoštevati pri interpretaciji rezultate.

Katere okužbe lahko odkrije ELISA?

Predvsem v sodobni venerologiji se uporablja za diagnozo sifilisa (v kombinaciji z drugimi reakcijami), okužbe s HIV, virusnega hepatitisa.Omejeno vrednost ima za diagnozo klamidijske okužbe, okužbe s citomegalovirusom in drugih herpetičnih okužb.Uporablja se tudi metoda ELISA. za določanje protiteles pri različnih nalezljivih boleznih, ravni hormonov, avtoprotiteles in različnih markerjev raka.

Kako razlagati rezultate ELISA

Preučevanje prisotnosti in ravni protiteles različnih razredov v nekaterih primerih pomaga določiti stopnje nalezljivega procesa.

Na žalost tako pomembna prednost ELISA, kot je kvantitativno določanje protiteles, ni velikega pomena pri praktično delo- tj. ne omogoča natančne diagnoze in ne vpliva na odmerjanje in čas jemanja zdravil.

Kakšna je vloga metode ELISA pri diagnostiki sifilisa

Metoda ELISA pri diagnozi sifilisa je bila prvič uporabljena leta 1975. Trenutno se v Rusiji pogosto uporablja za serološko diagnozo sifilisa in se uporablja kot potrditveni test za sifilis. Običajno se izvede študija, ki identificira t.i. celotna protitelesa proti antigenom Treponema pallidum (IgM in IgG), čeprav je v nekaterih primerih mogoče določiti le "zgodnja" protitelesa razreda M. ELISA za sifilis postane pozitiven po 3 tednih od trenutka okužbe in ostane pozitiven precej dolgo dolgo časa tudi po zdravljenju (včasih celo življenje).Zato se kot test, ki potrjuje ozdravitev sifilisa, ELISA ne uporablja.V večini primerov se izvaja le kvalitativna določitev ELISA - t.j. samo pozitiven ali negativen rezultat, možna pa je tudi kvantitativna določitev.

Okužba z virusom humane imunske pomanjkljivosti je resna diagnoza. Napake pri diagnozi lahko povzročijo katastrofalne posledice. HIV ELISA test je najbolj razpoložljiva metoda raziskave, vendar ni v vseh primerih informativna.

ELISA - encimski imunski test. Namen metode ELISA je odkrivanje protiteles proti virusu imunske pomanjkljivosti v biološkem materialu. Z uporabo metode lahko sledite prisotnosti v tekočini ne samih virusov, temveč le protiteles, ki nastanejo kot odgovor na njihovo prisotnost. Encimski imunski test se pogosto uporablja pri diagnozi spolno prenosljivih bolezni. Pomaga pri prepoznavanju spolno prenosljivih bolezni.

Obstaja več vrst ELISA: direktna različica, indirektna različica, sendvič metoda. Vsekakor pa tehnika temelji na ugotavljanju prisotnosti protiteles, ki služijo kot pokazatelj prodora tujka. Za identifikacijo teh "oznak" se biološka komponenta obdela z encimi.

Encimski imunski test določa protitelesa z natančnostjo 96–98%, napaka je nepomembna. Je 2-4%.

ELISA - metoda za diagnosticiranje HIV

Test ELISA za HIV je prva stopnja diagnoze. Antigeni virusa imunske pomanjkljivosti so proteini p24, p15, p17, p31 in glikoproteini gp 41, gp55, gp66, gp120, gp160.

Za odkrivanje virusnega proteina se vzame vzorec krvi iz vene. Vzorec, poslan na testiranje krvi ELISA, se obdela z reagenti za encimski imunski test. Serum izoliramo iz krvi. Če jih med študijo najdemo, to pomeni, da je virus že prisoten v krvi.

Krv se daruje strogo na prazen želodec. 2 dni pred testom ni priporočljivo jesti mastne hrane in piti alkohola. Za 14 dni morate prenehati jemati protivirusna zdravila.

Prednosti metode:

• relativno nizki stroški;
• visoka stabilnost reagentov;
• visoka občutljivost;
• kratko trajanje;
• minimalen vpliv človeškega faktorja.

Sodobni testni sistemi ELISA so izdelani v skladu z mednarodnimi standardi. To poveča natančnost metode.

Encimski imunski test ne daje vedno zanesljivih rezultatov. Ko virus vstopi v kri, se začne latentna (skrita) stopnja razvoja. Obdobje, preden se virusi začnejo razmnoževati in protitelesa še niso nastala, se imenuje "seronegativno okno". Na tej stopnji nima smisla izvajati ELISA. Če pride do okužbe, bo rezultat . Kako hitro se virus razkrije, je odvisno od tega, koliko nevarnih celic je vstopilo v telo. V primeru nezaščitenega spolnega odnosa ali transfuzije okužene krvi bo to obdobje minimalno.

Za visoko zanesljivost HIV ELISA se test izvede trikrat. Roki za opravljanje testa ELISA za virus humane imunske pomanjkljivosti:

• 6 tednov po verjetnem stiku,
• v 3 mesecih,
• šest mesecev kasneje.

ELISA 4. generacije za HIV je najbolj informativna metoda za zgodnje faze okužba. Lahko se izvaja že 1 mesec po sumu okužbe. Preizkus je drag v primerjavi z analogom 3. generacije. Zato se v javnih zdravstvenih ustanovah uporablja kot dodatna metoda diagnostiko Brezplačno se opravi test 3. Če na podlagi njegovih rezultatov ni mogoče podati dokončnega odgovora, se bolnik napoti na ELISA test 4. generacije.

Pomembno! Takoj po okužbi postane oseba kužna. Nevaren je za druge, tudi ko še ne ve za svojo diagnozo!

Če ELISA odkrije protitelesa proti antigenom HIV, je treba opraviti dodatne študije. To vključuje . Zanesljivost te metode je 80%. PCR test krvi, semena in izcedka iz nožnice. Biološka tekočina se razgradi v medicinskem reaktorju in nato obdela z encimi. Posledično dobimo podatke o koncentraciji celic HIV v tekočem mediju. Zaradi velike napake (20%), če je rezultat pozitiven, dodatno imunobloting.

Naslednja stopnja diagnoze je Combo test (ali imunobloting). To je zelo občutljiv test (98% zaupanje), ki se izvede, če so rezultati ELISA po 6 mesecih dvoumni.

Dekodiranje rezultatov ELISA

Čas dešifriranja je od 24 do 48 ur. Če nujno potrebujete informacije (obvezno kirurški poseg), dekodiranje se izvede v 2 urah. Pokrajinski zdravstveni centri nimajo vedno potrebnih reagentov. Vzorec se odvzame mestu nanosa se nato prenese v regijsko središče. V takih okoliščinah je rezultat viden v 1-2 tednih.

Rezultat encimskega imunskega testa je lahko pozitiven ali negativen; drugih možnosti ni.

Tudi če je bil rezultat začetnega in ponovnega testa ELISA pozitiven, bolnika ni mogoče prepoznati kot okuženega s HIV. Pridržujemo si pravico do napak. Vzroki za lažno pozitiven rezultat:

• kronične bolezni;
• dolgotrajne nalezljive bolezni;
• nosečnost.

Zato je treba rezultat analize pojasniti z dodatnimi študijami.

Če je imunobloting HIV pozitiven (reaktiven), se oseba šteje za okuženo s HIV, kar pomeni, da je zdrava.

Sčasoma se virusne celice prilagodijo predpisanim zdravilom. Za nadzor se test ELISA periodično ponavlja.

Včasih imunobloting pokaže lažno negativen rezultat. Zelo redko je, da imate virus imunske pomanjkljivosti 6 mesecev (ali več). To je mogoče, če majhna količina virusnih celic vstopi v kri. Pri 0,5 % vseh primerov lahko okužbo ugotovimo šele po enem letu. V 99,5 % šestih mesecih po okužbi bo test ELISA dal zanesljiv rezultat.

Tudi pri zelo natančnih študijah še vedno obstaja 2 % možnost napake. Ne smemo pozabiti na človeški faktor. Da bi odpravili možnost napake, lahko test opravite v 2 različnih ustanovah.

Z razvojem sorodnih ved, kot so genetika, molekularna biologija, kemija, pa tudi z rastjo tehnološkega napredka, sodobna medicina se ponaša z inovativnimi diagnostičnimi metodami za najbolj razne bolezni oseba. Odlikuje jih visoka natančnost rezultatov in varnost. Eden takšnih načinov za prepoznavanje zdravstvenih težav je encimski imunski test. V zadnjem desetletju je postala zelo priljubljena in si pridobila sloves zelo učinkovite, zanesljive in za pacienta varne metode odkrivanja bolezni še pred pojavom zunanji simptomi. Jasno bomo razložili, kaj je ta vrsta diagnostike, kakšno je načelo njenega delovanja, opazili bomo prednosti in dali napotke o stroških takšne analize.

Odziv telesa na patogeno floro

Da bi razumeli, kako laboratorijski tehniki s pomočjo encimskega imunskega testa diagnosticirajo razne bolezni, je treba razumeti fiziološki proces, ki se pojavi v telesu med okužbo. Ko patogen vstopi v krvni obtok, to pokaže človeški imunski sistem obrambna reakcija v obliki sproščanja določenih snovi – protiteles. Dotaknejo se celice in analizirajo, ali je del telesa ali je napadena od zunaj. Če imunski sistem ugotovi, da je celica tuja, začne naraščati število protiteles za boj proti patogenemu mikroorganizmu.

Obstajajo protitelesa različni tipi, imajo svoje značilnosti. Nekatere snovi se pojavijo neposredno v obdobju okužbe, druge ostanejo v človeškem telesu skozi vse življenje in zaradi njih se razvije stabilna imunost na določeno bolezen. Strukture beljakovin so razdeljene na naslednje vrste: A, D, E, M, G. V medicini se protitelesa imenujejo imunoglobulini. Zato je običajno, da indikatorje teh snovi označimo z latinskimi črkami Ig.

Temelji posebej na medicinskem znanju. Z uporabo posebnih antigenov v laboratorijskih pogojih je mogoče določiti prisotnost ali odsotnost določenih protiteles v biološkem materialu. Na podlagi rezultatov takšne analize lahko zdravnik postavi diagnozo in ugotovi ne le prisotnost patologije, temveč tudi, kako dolgo je nastala, in ugotovi stopnjo nevarnosti za bolnika. Pri encimskih imunskih testih najpogosteje preverjamo prisotnost protiteles skupin M in G.

Kaj je ELISA?

Pravzaprav encimski imunski test v sodobni družbi ni novost. Izumili so ga že v 80. letih. Toda izvajanje takšnih raziskav je zahtevalo zajetno in drago opremo. Zato so to metodo uporabljali le v posebej opremljenih znanstvenih laboratorijih: uporabljali so jo za tipizacijo celic in tkiv. Toda takrat se v diagnostični medicini ni veliko uporabljal; uporaba je bila tehnično težka in izjemno draga. Šele z razvojem tehnologije in izumom biopolimernih materialov se je ELISA izboljšala. Nato se je metoda začela popularizirati in pridobivati ​​zaupanje v medicinskih krogih.

Kot je navedeno zgoraj, ta metoda pomeni odkrivanje določenih skupin imunoglobulinov v biomaterialu - krvi, amnijski tekočini, steklastem telesu ali cerebrospinalni tekočini.

Obstajajo študije brez nanašanja antigena na površino in encimski imunski test, ki vključuje izvedbo reakcije v posebnih vdolbinicah. Slednja metoda ima večjo občutljivost in zanesljivost, zato se tako izvajajo analize v medicinskih laboratorijih za odkrivanje človeških bolezni.

Faze encimskega imunskega testa

Odvisno od domnevne bolezni se uporabi potreben antigen iz kompleta za encimski imunski test, ki bo med kemično reakcijo v prisotnosti okužbe stopil v stik s patogeno floro. Ta proces se imenuje vodenje imunskega odziva.

Nato se za vizualno določitev rezultata študije izvede encimska faza ELISA. Vključuje barvanje materiala s posebnimi reagenti. IN ta študija uporabljajo se encimi kot npr alkalna fosfataza, peroksidazo in avidin. Glede na nastalo barvo med kemičnimi reakcijami se določi rezultat encimskega imunskega testa.

Kaj je kolorimetrija?

Analiza encimske diagnostične faze se izvaja z metodo, imenovano "kolorimetrija". Dejstvo je, da informacije o okužbi ne daje le barva materiala, temveč tudi gostota barve, ki je posledica kemičnih reakcij. Ta indikator določa koncentracijo patogenega mikroorganizma. Če se na staromoden način uporablja ročna diagnostična metoda, se za določitev navedenih indikatorjev zgradi poseben kalibracijski graf.

V sodobnih laboratorijih se danes ročna metoda redko uporablja. Za izvedbo analize ELISA se uporablja posebna naprava - kolorimeter, v katerem so ročno nastavljeni samo raziskovalni parametri, nato pa vse delo, vključno z risanjem, izvede naprava samodejno.

ELISA metode

Obstajajo neposredne in posredne metode encimskega imunskega testa. Prva vrsta traja manj časa, saj ima samo 3 stopnje izvedbe. Najprej se antigenom testnega materiala dodajo specifična protitelesa, ki so postavljena v posebne vdolbinice. Nato odvečno količino odstranimo in izvedemo encimsko fazo analize ter tako pridobimo rezultat.

Indirektna metoda se uporablja veliko pogosteje, saj ima večjo občutljivost v primerjavi z neposredno diagnostično metodo. Pri izvajanju se uporablja dvojna študija. Antigen se namreč najprej poveže z neoznačenim protitelesom, nato pa z označenim. Ta postopek traja dlje, vendar je rezultat najbolj natančen.

Kompleti reagentov

Izdelujejo se kompleti za encimske imunske teste različnih proizvajalcev, v različnih konfiguracijah. V Rusiji je podjetje "Soyuz Medical-Biological" priznano. Ta proizvajalec proizvaja reagentne komplete za študijo z ELISA skoraj vseh pogostih okužb v naših zemljepisnih širinah, ki jih je mogoče analizirati na ta način. Kompleti poleg samih reagentov vsebujejo dodatne materiale, kar zagotavlja varnost, priročnost in hitrost analize. Poleg tega so kemične snovi obarvane različne barve, kar zmanjša verjetnost napake pri izbiri reagenta s strani laboratorijskega pomočnika.

Kemijske in biološke komplete odlikuje relativna dostopnost, kar neposredno vpliva na distribucijo in dostopnost encimskih imunskih testov za prebivalstvo.

Prednosti diagnostične metode

Nedvomno ima encimski imunski test številne prednosti v primerjavi z drugimi diagnostičnimi metodami:

1. Z njegovo pomočjo lahko določite celo rahlo prisotnost patogenih organizmov, kar kaže na visoko občutljivost testa.
2. Sposobnost odkrivanja bolezni največ zgodnje faze, kar bistveno poveča možnost uspešne ozdravitve.
3. Enostavnost in priročnost odvzema biološkega materiala. Ta analiza se izvaja v zasebnih in državnih laboratorijih. Po potrebi lahko material odvzame medicinska sestra od pacientovega doma.
4. Za analizo je potrebna zelo majhna količina biomateriala.
5. Hitro dobite rezultate. Sodobna medicinska oprema omogoča analizo v 24 urah.
6. Možnost odkrivanja skritih asimptomatskih oblik okužbe.
7. Razpoložljivost študije.
8. Po potrebi je mogoče s to metodo opraviti množične preglede.
9. Možno je spremljati potek bolezni in učinkovitost predpisanega zdravljenja, saj je test ELISA mogoče opraviti večkrat, popolnoma varno za bolnika.
10. Avtomatizacija stopenj analize, ki odpravlja človeški faktor in povečuje zanesljivost rezultatov.
11. Reagenti za ELISA so shranjeni precej dolgo - približno eno leto.
12. Analiza je možna pri nihanju temperature okolja.

Imunoglobulini skupine M

Nastajajo protitelesa skupine M imunski sistem takoj po odkritju tujega antigena. Posledično, če je encimski imunski test odkril takšne snovi v biomaterialu, potem to kaže na akutno fazo bolezni, primarno okužbo. Imunoglobulini skupine M lahko ostanejo v telesu do enega meseca, odvisno od vrste okužbe. Nato se njihovo število zmanjšuje, dokler popolnoma ne izginejo.

Imunoglobulini skupine G

Imunoglobuline skupine M nadomestijo proteinske strukture tipa G. Te snovi razvijejo stabilno, v večini primerov vseživljenjsko imunost na bolezen. Določitev proteinske strukture IgG v testnem materialu kaže, da se je telo že srečalo s patogenom in ima zaščitno reakcijo proti ponovni okužbi.

Indikacije za diagnozo

Encimski imunski test krvi se uporablja za določanje različnih nalezljive bolezni, hormonska stanja, naredite alergotest. namreč:

• določite raven hormonov Ščitnica;
• indikatorji reproduktivne hormonske plošče;
• tumorski markerji;
• odkrivanje povzročiteljev nalezljivih bolezni, kot so citomegalovirus, hepatitis, toksoplazma, rdečke, ošpice, tuberkuloza, klamidija, sifilis, mikoplazma, ureplazma, kandida, lamblia in celo HIV;
• diagnosticirane so avtoimunske bolezni. Med drugim se encimski imunski testi pogosto uporabljajo za preučevanje ščitničnih hormonov: TSH, TG, T3 in T4.

Poleg diagnostičnih namenov se metoda encimskega imunskega testa uporablja v medicinskih raziskovalnih dejavnostih.

Kako poteka zbiranje gradiva?

V večini primerov se za analizo priporoča odvzem venske krvi. Po obdelavi in ​​pripravi materiala za raziskave se izvede encimski imunosorbentni test krvnega seruma ali plazme.

Študija hormonske plošče zahteva posebno pozornost, saj je v tem primeru izredno pomembno upoštevati značilnosti zbiranja materiala. Na primer, za diagnosticiranje večine hormonov v ženskem reproduktivnem sistemu je treba odvzeti vensko kri določene dni menstrualni ciklus. Deluje na številne druge hormone zunanji dejavniki: sezonskost, čas dneva, psihološko stanje potrpežljivost in še veliko več. Brez upoštevanja posebnih dejavnikov lahko dobite napačen rezultat, kar bo povzročilo poslabšanje bolezni ali nepravilno predpisano zdravljenje.

V nekaterih, pogosteje zapletenih primerih bo morda potrebna analiza cerebrospinalna tekočina, steklovino ali amnijsko tekočino nosečnice. Postopki za zbiranje teh biološki materiali nosijo določeno tveganje, imajo kontraindikacije in obdobje okrevanja. Zato je treba takšen encimski imunski test izvajati le po navodilih zdravnika in pod njegovim strokovnim nadzorom. Dešifriranje v tem primeru zahteva posebno medicinsko znanje in lahko traja nekaj časa.

Priprava na analizo

Encimski imunski test je treba izvesti v skladu z vsemi priporočili, saj na rezultate študije vplivajo zunanji dejavniki. Na primer, pomembno je darovati vensko kri na tešče zjutraj (pred 11. uro). 2 tedna pred predvidenim odvzemom materiala morate prenehati jemati zdravila, predvsem hormonskih. Nekaj ​​​​dni pred testom se morate vzdržati pitja alkohola in mastne hrane ter se izogibati telesna aktivnost, izkušnje in stres.

Dešifriranje rezultatov

Dešifriranje rezultatov encimskega imunskega testa zahteva posebno znanje o značilnostih zgoraj opisanih beljakovinskih struktur (protiteles) (IgG in IgM). V skladu s temi podatki se analizirajo raziskovalni kazalci. V tabeli so opisane možnosti, ki jih je mogoče dobiti med analizo:

Če analiziramo predstavljeno tabelo, lahko sklepamo, da bodo v večini primerov za potrditev diagnoze potrebne dodatne študije. Samo encimski imunski test ne more dati dokončnega odgovora. Norma v tem primeru nima jasnih meja: odkriti proteini skupine G kažejo le, da je bilo telo predhodno okuženo s prepoznavnim patogenom. Toda isti rezultat lahko kaže tudi na prisotnost akutne faze - za pravilno diagnozo je pomembno primerjati številne dejavnike in kazalnike.

Dejavniki tveganja

ELISA je 90 % natančna. Kljub temu obstajajo dejavniki tveganja, ki vplivajo na izkrivljanje diagnostičnega rezultata: okvara opreme, nepravilno zbiranje materiala, njegovo shranjevanje in prevoz, neupoštevanje drugih zunanjih dejavnikov.

Stroški analize

Stroški diagnostičnega testa so v širokem razponu in so odvisni od vrste analize in antigena, ki se določa, saj se na podlagi teh dejavnikov izračunajo stroški kompleta reagentov in določi kompleksnost analize. Toda v večini primerov je encimski imunski test na voljo mnogim bolnikom. Njegova cena se začne od 300 rubljev. do 2000 rub.

ELISA je cenovno dostopna, hitra in zelo učinkovita metoda za diagnosticiranje širokega seznama bolezni. Toda samo usposobljeni zdravnik ima pravico razlagati rezultate in postaviti diagnozo.