Virolojik araştırma yöntemleri. Virolojik çalışmalar Doğrudan virolojik yöntem

Virolojik araştırma yöntemleri- virüslerin biyolojisini ve bunların tanımlanmasını inceleme yöntemleri. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nüfuz etme yöntemlerini ve viral üreme özelliklerini, viral nükleik asitlerin ve proteinlerin birincil yapısını oluşturmanın mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerinin kurucu elemanlarının dizisini belirlemek için yöntemler geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve kodladıkları proteinlerin fonksiyonlarını nükleotid dizisine bağlamak ve viral enfeksiyonun patogenezinde önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini belirlemek mümkün hale gelir.

Virolojik araştırma yöntemleri aynı zamanda immünolojik süreçlere (antijenin antikorlarla etkileşimi) dayanmaktadır. biyolojik özellikler virüsün özellikleri (hemaglutinasyon yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özellikleri (sitopatik etkinin doğası, hücre içi kapanımların oluşumu vb.).

Teşhiste viral enfeksiyonlar Virüslerin yetiştirilmesinde, izolasyonunda ve tanımlanmasında ve ayrıca aşı preparatlarının üretiminde doku ve hücre kültürü yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincil, ikincil, stabil sürekli ve diploid hücre kültürleri kullanılır. Birincil kültürler, dokuyu proteolitik enzimler (tripsin, kollajenaz) ile dağıtarak elde edilir. Hücrelerin kaynağı insan ve hayvan embriyolarının doku ve organları (genellikle böbrekler) olabilir. Besin ortamındaki hücrelerin bir süspansiyonu şiltelere, şişelere veya Petri kaplarına yerleştirilir; burada hücreler kabın yüzeyine bağlandıktan sonra çoğalmaya başlar. Virüs enfeksiyonu için genellikle bir hücre tek katmanı kullanılır. Besin sıvısı boşaltılır, belirli seyreltmelerde viral süspansiyon eklenir ve hücrelerle temas ettirildikten sonra genellikle serumsuz taze besin ortamı eklenir.

Birincil kültürlerin çoğunun hücreleri alt kültürlenebilir; böyle bir kültüre ikincil kültür denir. Hücrelerin daha fazla geçişiyle, hızlı çoğalma yeteneğine sahip, çoğu orijinal kromozom setini koruyan fibroblast benzeri hücre popülasyonu oluşur. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri olarak kültürlenmesiyle stabil sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid kromozom setine sahip, hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre çizgileri tek katmanlı veya süspansiyonlu olabilir. Tek katmanlı kültürler cam yüzey üzerinde sürekli bir katman şeklinde büyürken, süspansiyon kültürleri ise karıştırma cihazları kullanılarak çeşitli kaplarda süspansiyonlar şeklinde büyür. 40'tan fazla türetilmiş 400'den fazla hücre dizisi vardır. çeşitli türler hayvanlar (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlar.

Yapay olarak besin ortamı bireysel organ ve doku parçalarının kültürü yapılabilir (organ kültürleri). Bu tür kültürler, özellikle farklılaşmamış doku kültürlerinde çoğalmayan virüslerin (örneğin, koronavirüsler) izolasyonu ve geçişi için önemli olan doku yapısını korur.

Enfekte olmuş durumda hücre kültürleri virüsler, hücre morfolojisindeki değişikliklerle, spesifik olabilen sitopatik etkilerle, kalıntıların ortaya çıkmasıyla, hücredeki ve kültür sıvısındaki viral antijenlerin belirlenmesiyle tespit edilebilir; kültür sıvısındaki viral nesillerin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve doku kültüründe, tavuk embriyolarında veya hassas hayvanlarda virüslerin titre edilmesi; Hücrelerdeki bireysel viral nükleik asitlerin moleküler hibridizasyon yoluyla veya nükleik asit birikimlerinin floresan mikroskopi kullanılarak sitokimyasal yöntemle tanımlanması yoluyla.

Virüsleri izole etmek emek yoğun ve zaman alıcı bir süreçtir. Popülasyon arasında dolaşan virüsün tipini veya varyantını belirlemek için gerçekleştirilir (örneğin, grip virüsünün bir serovaryantını, çocuk felci virüsünün yabani veya aşı suşunu vb. tanımlamak için); acil epidemiyolojik önlemlerin alınmasının gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya çeşitleri ortaya çıktığında; gerekirse ön tanıyı onaylayın; nesnelerdeki virüsleri belirtmek için çevre. Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalma olasılıklarının yanı sıra iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun meydana gelme olasılığı dikkate alınır. Bir viriondan elde edilen virüsün genetik olarak homojen popülasyonuna viral klon denir ve bunu elde etme sürecine klonlama denir.

Virüsleri izole etmek için duyarlı laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu ve tavuk embriyoları kullanılır, ancak çoğunlukla doku kültürü kullanılır. Bir virüsün varlığı genellikle spesifik hücre dejenerasyonu (sitopatik etki), semplast ve sinsit oluşumu, hücre içi kapanımların tespiti ve ayrıca immünofloresan, hemadsorpsiyon, hemaglutinasyon (hemaglutinasyon virüsleri için) vb. kullanılarak tespit edilen spesifik bir antijen ile belirlenir. . Bu belirtiler ancak virüsün 2-3 geçişinden sonra tespit edilebiliyor.

Tavuk embriyoları, grip virüsleri gibi bir dizi virüsü izole etmek için kullanılır ve yeni doğmuş fareler, bazı Coxsackie virüslerini ve bir dizi arbovirüsü izole etmek için kullanılır. İzole edilmiş virüslerin tanımlanması kullanılarak gerçekleştirilir. serolojik reaksiyonlar ve diğer yöntemler.

Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüslerin titrasyonu genellikle doku kültüründe gerçekleştirilir; doku dejenerasyonunun meydana geldiği virüs içeren sıvının en yüksek seyreltmesi belirlenir, kalıntılar ve virüse özgü antijenler oluşturulur. Plak yöntemi birçok virüsün titre edilmesinde kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, agar kaplaması altında tek katmanlı bir doku kültüründe virüs tarafından yok edilen hücrelerin odaklarıdır. Koloni sayımı, bir bulaşıcı virüs parçacığının bir plak oluşturması temelinde virüslerin bulaşıcı aktivitesinin niceliksel bir analizine olanak tanır. Plaklar, kültürün genellikle nötr kırmızı olan intravital boyalarla boyanmasıyla tespit edilir; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planında hafif noktalar olarak görülebilir. Virüs titresi, 1 beher başına plak oluşturan ünite sayısı olarak ifade edilir. ml.

Virüslerin saflaştırılması ve konsantrasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme ve ardından konsantrasyon veya yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile gerçekleştirilir. Virüsleri saflaştırmak için immünolojik yöntemler, iyon değişim kromatografisi, immünosorbentler vb. kullanılır.

Viral enfeksiyonların laboratuvar tanısı, klinik materyalde patojenin veya bileşenlerinin tespitini içerir; virüsün bu materyalden izole edilmesi; serolojik tanı. Bir yöntem seçme laboratuvar teşhisi her bir vakada hastalığın doğasına, hastalığın süresine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Modern teşhis viral enfeksiyonlar, klinik materyali aldıktan birkaç saat sonra cevap almanızı sağlayan ekspres yöntemlere dayanmaktadır. erken tarihler hastalıktan sonra, Bunlar arasında elektron ve immün elektron mikroskobunun yanı sıra immünofloresan, moleküler hibridizasyon yöntemi, IgM sınıfı antikorların tespiti vb. yer alır.

Negatif boyalı virüslerin elektron mikroskobu, virüsleri ayırt etmeyi ve konsantrasyonlarını belirlemeyi mümkün kılar. Viral enfeksiyonların tanısında elektron mikroskobunun kullanımı, klinik materyaldeki viral partikül konsantrasyonunun oldukça yüksek olduğu durumlarla sınırlıdır (10 5'te 1). ml Ve daha yüksek). Yöntemin dezavantajı aynı taksonomik gruba ait virüslerin ayırt edilememesidir. Bu eksiklik immün elektron mikroskobu kullanılarak giderilir. Yöntem, viral partiküllere spesifik serum eklenirken aynı anda viral partiküllerin yoğunlaştırılarak tanımlanmasına olanak tanıyarak bağışıklık komplekslerinin oluşturulmasına dayanıyor. Yöntem aynı zamanda antikorları tespit etmek için de kullanılır. Açık teşhis amacıyla, doku ekstraktlarının, dışkıların, keseciklerden gelen sıvının ve nazofarenks salgılarının elektron mikroskobik incelemesi gerçekleştirilir. Elektron mikroskobu, virüsün morfogenezini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır; etiketli antikorların kullanımıyla yetenekleri genişletilmektedir.

Virüse özgü nükleik asitlerin tespitine dayanan moleküler hibridizasyon yöntemi, genlerin tek kopyalarının tespit edilmesini mümkün kılar ve hassasiyet açısından eşi benzeri yoktur. Reaksiyon, tamamlayıcı DNA veya RNA iplikçiklerinin (problar) hibridizasyonuna ve çift iplikli yapıların oluşumuna dayanır. En ucuz prob klonlanmış rekombinant DNA'dır. Prob, radyoaktif öncüllerle (genellikle radyoaktif fosfor) etiketlenmiştir. Kolorimetrik reaksiyonların kullanımı umut vericidir. Moleküler hibridizasyon için çeşitli seçenekler vardır: spot hibridizasyon, leke hibridizasyon, sandviç hibridizasyon, yerinde hibridizasyon vb.

IgM sınıfına ait antikorlar, G sınıfına ait antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3.-5. gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, dolayısıyla bunların tespiti yeni bir enfeksiyona işaret eder. IgM sınıfının antikorları immünofloresan veya kullanılarak tespit edilir. enzim immünolojik tahlili anti-m antiserumları (IgM ağır zincirlerine karşı serumlar) kullanılarak.

Virolojideki serolojik yöntemler klasik immünolojik reaksiyonlara dayanmaktadır (bkz. İmmünolojik araştırma yöntemleri ): kompleman fiksasyon reaksiyonları, hemaglütinasyon inhibisyonu, biyolojik nötralizasyon, immünodifüzyon, dolaylı hemaglutinasyon, radyal hemoliz, immünfloresan, enzim immünolojik testi, radyoimmünoanaliz. Pek çok reaksiyon için mikro yöntemler geliştirilmiş ve teknikleri sürekli olarak geliştirilmektedir. Bu yöntemler, bilinen bir dizi serum kullanarak virüsleri tanımlamak ve ikinci serumdaki antikorlardaki birinciye kıyasla artışı belirlemek için serodiagnoz için kullanılır (ilk serum hastalıktan sonraki ilk günlerde alınır, ikincisi - 2-2'den sonra). 3 hafta). Tanısal değer, ikinci serumdaki antikorlarda dört kattan az bir artış değildir. IgM sınıfına ait antikorların tespiti yeni bir enfeksiyonu gösteriyorsa, IgC sınıfına ait antikorlar birkaç yıl, bazen de ömür boyu devam eder.

Proteinlerin ön saflaştırılması olmadan karmaşık karışımlarda virüslerin ayrı ayrı antijenlerini ve bunlara karşı antikorları tanımlamak için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak protein fraksiyonasyonunu ve ardından enzim immünoanaliz yöntemini kullanarak proteinlerin immüno-endikasyonunu birleştirir. Protein ayrımı, antijenin kimyasal saflığına ilişkin gereksinimleri azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin tanımlanmasını mümkün kılar. Bu görev, örneğin, yanlış pozitif enzime bağlı immünosorbent tahlil reaksiyonlarının, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak mevcut olan hücresel antijenlere karşı antikorların varlığından kaynaklandığı HIV enfeksiyonunun serodiagnozu ile ilgilidir. Hasta serumlarında iç ve dış viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, hastalığın evresini ve popülasyonları analiz ederken viral proteinlerin değişkenliğini belirlemeyi mümkün kılar. HIV enfeksiyonu için immünoblotlama, bireysel viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tanımlamak için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. Yöntemin büyük değeri, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenlerin analiz edilmesi, boyutlarının ve antijenik belirleyicilerin varlığının belirlenmesi olasılığında yatmaktadır.

Etiolojik tanı viral hastalıklar virolojik, virüsoskopik, serolojik ve moleküler genetik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. Son üç yöntem hızlı teşhis yöntemleri olarak kullanılabilir.

Virolojik tanı yöntemi.

Yöntemin nihai amacı virüsleri türlere veya serolojik varyantlara göre tanımlamaktır. Virolojik yöntem birkaç aşama içerir:

1) araştırma için materyal seçimi;

2) virüs içeren materyalin işlenmesi;

3) hassas yaşam sistemlerinin materyalle kirlenmesi;

4) canlı sistemlerdeki virüslerin göstergesi;

5) izole edilmiş virüslerin titrasyonu;

6) bağışıklık reaksiyonlarında virüslerin tanımlanması.

1. Araştırma için materyal seçimi .

Malzemenin yabancı mikroflora ve enfeksiyonla kirlenmesini önleyen kurallara tabi olarak hastalığın erken aşamalarında gerçekleştirilir. sağlık personeli. Taşıma sırasında virüslerin inaktivasyonunu önlemek için malzeme, dengeli bir tuz çözeltisi, antibiyotikler ve serum albüminden oluşan bir viral taşıma ortamına (VTS) yerleştirilir. Malzeme, ısı yalıtımlı özel bir kap ve buz içeren kapalı plastik torbalar içerisinde taşınır. Gerektiğinde malzeme -20˚C'de saklanır. Araştırmaya yönelik her materyal örneği, hastanın adını, materyalin türünü, toplanma tarihini, genişletilmiş tarihini belirterek işaretlenmeli ve etiketlenmelidir. klinik tanı ve diğer bilgiler.

Hastalığın doğasına bağlı olarak araştırma materyali şunlar olabilir:

1) farenksin burun kısmından sürüntüler ve farenksten bir sürüntü;

2) beyin omurilik sıvısı;

3) dışkı ve rektal sürüntüler;

6) seröz boşluklardan gelen sıvı;

7) konjonktivadan smear;

8) keseciklerin içerikleri;

8) kesit malzemesi.

Orofarinksten bir yıkama elde etmek için 15-20 ml VTS kullanılır. Hasta VTS'yi 1 dakika boyunca dikkatlice gargara yapar ve durulamayı steril bir şişede toplar.

ile bulaşmak arka duvar boğazlar steril bir pamuklu çubukla alınır, dil köküne bir spatula ile bastırılır. Tampon 2-3 ml VTS'ye konulur, durulanır ve sıkılır.

Beyin omurilik sıvısı omurilik musluğu yoluyla elde edilir. 1-2ml Beyin omurilik sıvısı Steril kaplara konularak laboratuvara teslim edilir.

Dışkı örnekleri 2-3 gün içerisinde steril flakonlarda toplanır. Elde edilen malzemeden Hanks çözeltisi kullanılarak %10'luk bir süspansiyon hazırlanır. Süspansiyon 3000 rpm'de santrifüjlenir, süpernatan toplanır, antibiyotikler eklenir ve steril bir kaba yerleştirilir.

Damar yolu ile elde edilen 5-10 ml hacimdeki kan, heparin eklenerek defibrine edilir. Tam kan dondurulmaz ve antibiyotik eklenmez. Serum elde etmek için kan örnekleri 37˚C sıcaklıktaki termostatta 60 dakika bekletilir.

Seröz boşluklardan 1-2 ml miktarında delinerek sıvı elde edilir. Sıvı hemen kullanılır veya dondurularak saklanır.

Steril bir çubukla konjonktivadan bir smear alınır ve bir VTS'ye yerleştirilir, ardından toplanan materyal santrifüjlenir ve dondurulur.

Veziküllerin içeriği ince iğneli bir şırınga ile aspire edilerek VTS'ye yerleştirilir. Materyal, cam slaytlar üzerinde kurutulmuş smearlar halinde veya kapalı steril kılcal damarlar veya ampuller içerisinde laboratuvara gönderilir.

Kesit malzemesi aseptik kurallara uyularak mümkün olduğu kadar erken seçilir. Her numuneyi toplamak için ayrı steril alet setleri kullanılır. Alınan doku miktarı 1-3 gr olup steril flakonlara konulur. Öncelikle ekstrakaviter organlardan (beyin, beyin) örnekler alınır. Lenf düğümleri ve benzeri.). Kumaşlar Göğüs boşluğu açmadan önce al karın boşluğu. Elde edilen doku örnekleri, steril kum ve steril sodyum klorür çözeltisi ilavesiyle bir havanda öğütülür ve ardından malzeme santrifüjlenir. Süpernatan şişelerde toplanır ve antibiyotikler eklenir. Virolojik araştırma materyali hemen kullanılır veya -20˚C'de saklanır.

2. Virüs içeren materyalin işlenmesi.

Malzemeyi eşlik eden bakteriyel mikrofloradan kurtarmak amacıyla gerçekleştirilir. Bu amaçla fiziksel ve kimyasal yöntemler kullanılmaktadır.

Fiziksel yöntemler:

1) çeşitli bakteri filtrelerinden filtreleme;

2) santrifüjleme.

Kimyasal yöntemler:

1) süper kapsid içermeyen virüslerin izolasyonu durumunda malzemenin eter ile işlenmesi;

2) malzemeye bir heptan ve freon karışımının eklenmesi;

3) antibiyotiklerin uygulanması (penisilin - 200-300 U/ml; streptomisin - 200-500 mcg/ml; nistatin - 100-1000 U/ml).

3. Hassas yaşam sistemlerinin materyalle kirlenmesi.

1) laboratuvar hayvanları;

2) tavuk embriyoları;

3) organ kültürü;

4) doku kültürü.

Laboratuvar hayvanları. Beyaz fareler, kobaylar, hamsterlar, tavşanlar vb. kullanılır.Beyaz fareler en duyarlı olanlardır. Büyük bir sayı virüs türleri. Hayvanları enfekte etme yöntemi, virüsün dokulara olan tropizmi tarafından belirlenir. Beyindeki enfeksiyon, nörotropik virüslerin (kuduz virüsleri, çocuk felci virüsleri vb.) izole edilmesinde kullanılır. Burun içi enfeksiyon patojenler izole edildiğinde gerçekleştirilir solunum yolu enfeksiyonları. Kas içi, damar içi, periton içi, deri altı ve diğer enfeksiyon yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Hasta hayvanlara eterle ötenazi yapılıyor, açılıyor, organ ve dokulardan materyal toplanıyor.

Tavuk embriyoları. Yaygın olarak bulunur ve kullanımı kolaydır. 5 ila 14 günlük tavuk embriyoları kullanılır. Enfeksiyondan önce tavuk embriyoları ovoskopiktir: canlılıkları belirlenir, hava kesesinin sınırı ve embriyonun yeri kabuk üzerinde işaretlenir (“ Kara göz"embriyo). Tavuk embriyolarıyla çalışma, steril aletlerle (cımbız, şırınga, makas, mızrak vb.) Steril bir kutuda gerçekleştirilir. Bir iş tamamlandıktan sonra aletler %70 oranında suya daldırılır. etanol ve bir sonraki manipülasyondan önce yakılırlar. Enfeksiyondan önce, tavuk embriyosunun kabuğu yanan alkollü bir bezle silinir ve alkol solüsyonu Yoda. Embriyoya enjekte edilen test materyalinin hacmi 0,1-0,2 ml'dir. Virüsleri bir materyalden izole etmek için en az 4 tavuk embriyosu kullanılır.

Virolojik araştırmalar iki ana aşamayı içerir: virüslerin izolasyonu ve tanımlanması. Virolojik araştırmaların materyali kan, diğer biyolojik ve patolojik sıvılar, organ ve doku biyopsileri olabilir.

Arboviral enfeksiyonları teşhis etmek için sıklıkla virolojik kan testleri yapılır. Kuduz virüsleri tükürükte bulunabilir, kabakulak, herpes simpleks, Nazofaringeal sürüntüler, grip ve diğer akut solunum yolu viral enfeksiyonları, kızamık patojenlerini izole etmek için kullanılır. Adenovirüsler konjonktival sürüntülerde bulunur. Dışkıdan çeşitli entero-, adno-, pso-, nora- ve rotavirüsler izole edilir.

Virüsleri izole etmek için hücre kültürleri, tavuk embriyoları ve bazen laboratuvar hayvanları kullanılır.

Patojenik virüslerin çoğu, doku ve tip spesifikliğinin varlığıyla ayırt edilir; örneğin, çocuk felci virüsü yalnızca primat hücrelerinde çoğalır, dolayısıyla belirli bir virüsü izole etmek için uygun bir doku kültürü kullanılır. Bilinmeyen bir patojeni izole etmek için, içlerinden birinin hassas olabileceği varsayılarak 3-4 hücre kültürünün aynı anda enfekte edilmesi tavsiye edilir. Enfekte olmuş hücre kültürlerinde virüsün varlığı, spesifik hücre dejenerasyonunun gelişimi ile belirlenir; sitopatojen etkisi, hücre içi inklüzyonların tespiti ve ayrıca spesifik bir antijenin immünofloresan, pozitif hemadsorpsiyon ve hemaglutinasyon reaksiyonları ile tespitine dayanmaktadır.

Kuş embriyoları, az farklılaşmış dokuları nedeniyle birçok virüsün yetiştirilmesine uygundur. Çoğu zaman tavuk embriyoları kullanılır. Virüsler embriyolarda çoğalırken ölümlerine (arbovirüsler), koryon-allantoik membranda (çiçek virüsleri) veya embriyonun vücudunda değişikliklerin ortaya çıkmasına, embriyonik sıvılarda gluten birikmesine (grip virüsleri, kabakulak) neden olabilir. ) ve tamamlayıcı bağlayıcı viral antijen.

Virüslerin tanımlanması immünolojik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir: hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu, kompleman fiksasyonu, nötrleştirme, jel çökeltme, immünofloresan.

Konuyla ilgili daha fazla bilgi: Virolojik yöntem:

1. Temel antropometrik verilerin parametrik yöntem (sigma yöntemi) kullanılarak değerlendirilmesi
2. Koşullu iletişimin yok edilmesi yöntemi ve zorla eğitim yöntemi kullanılarak tedavi
3. 2. Karşılaştırmalı hukuk yöntemi - hukuk biliminin özel bilimsel yöntemi
4. SUBMUKÖZ UTERİN FİBROİDİNDE MODERN TEŞHİS YÖNTEMLERİ VE TEDAVİ YÖNTEMİ SEÇİMİ
5. 5.4. Pratik bir faaliyet yöntemi olarak genel araştırma yönteminin kavramı ve yapısı
6. Konu 8. KALITILI BİLGİNİN DEĞİŞKENLİK VE İLETİM MEKANİZMALARININ İNCELENMESİ İÇİN MİKROBİYOLOJİK YÖNTEMLER. YENİ İLAÇLARIN YARATILMASI İÇİN GENETİK YÖNTEMLERİN UYGULANMASI
7. Konu 15. MİKROORGANİZMALARIN PATOJENİSİ VE VİRÜLANSI. VİRÜLANS FAKTÖRLERİ. LABORATUVAR HAYVANLARININ ENFEKSİYON YÖNTEMLERİ. ANTİJENLER, ELDE EDİLME YÖNTEMLERİ. ANTİKORLAR. BAĞIŞIKLIK REAKSİYONLARI VE PRATİK KULLANIMI. FAGOSİTOZ

Virolojik yöntem iki ana aşamayı içerir: virüslerin izolasyonu ve tanımlanması. Malzemeler kan, diğer biyolojik ve patolojik sıvılar, organ ve doku biyopsileri olabilir.

Arboviral enfeksiyonları teşhis etmek için sıklıkla virolojik kan testleri yapılır. Kuduz, kabakulak ve herpes simpleks virüsleri tükürükte tespit edilebilir. Nazofaringeal sürüntüler, grip ve diğer akut solunum yolu viral enfeksiyonları ve kızamık patojenlerini izole etmek için kullanılır. Adenovirüsler konjonktival sürüntülerde bulunur. Dışkıdan çeşitli entero-, adeno-, reo- ve rotavirüsler izole edilir.

Virüsleri izole etmek için hücre kültürleri, tavuk embriyoları ve bazen laboratuvar hayvanları kullanılır. Çoğu patojenik virüs, doku ve tür spesifikliğinin varlığıyla ayırt edilir, örneğin, çocuk felci virüsü yalnızca primat hücrelerinde çoğalır, bu nedenle belirli bir virüsü izole etmek için uygun bir doku kültürü kullanılır. Bilinmeyen bir patojeni izole etmek için, Birinin duyarlı olabileceği varsayılarak aynı anda 3-4 hücre kültürünü enfekte edin.Enfekte kültürlerde virüsün varlığı, spesifik hücre dejenerasyonunun gelişimi, yani sitopatojenik etki, hücre içi kapanımların tespiti ve ayrıca Spesifik bir antijenin immünfloresan, pozitif hemadsorpsiyon ve hemaglutinasyon reaksiyonları ile tespitine dayanır.Kötü farklılaşmış dokuları olan kuş embriyoları birçok virüsün yetiştirilmesi için uygundur.Çoğunlukla tavuk embriyoları kullanılır.Embriyolarda çoğaldıklarında virüsler ölümlerine neden olabilir. (arbovirüsler), koryon-allantoik membranda (çiçek virüsleri) veya embriyonun vücudunda değişikliklerin ortaya çıkması, embriyonik sıvılarda hemaglutininlerin birikmesi (influenza virüsleri, kabakulak ) ve kompleman sabitleyici viral antijen.

Virüsler immünolojik yöntemler kullanılarak tanımlanır: hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu, kompleman fiksasyonu, nötralizasyon, jel çökeltme, immünofloresan.

3.4 Biyolojik yöntem

Biyolojik yöntem patojeni belirtmek için laboratuvar hayvanlarının çeşitli malzemelerle (klinik, laboratuvar) enfekte edilmesinden ve ayrıca patojenitelerini karakterize eden mikroorganizmaların bazı özelliklerinin (toksijenite, toksisite, virülans) belirlenmesinden oluşur. Laboratuvar hayvanları olarak beyaz fareler, beyaz sıçanlar, kobaylar, tavşanlar vb. kullanılır.

Hastalığın bir hayvanda üremesi, izole edilen mikroorganizmanın (kuduz, tetanoz vb. durumunda) patojenitesinin kesin kanıtıdır. Bu nedenle, hayvanlar üzerinde yapılan biyolojik bir test, özellikle patojenleri insan vücudunun incelenen biyolojik ortamında düşük konsantrasyonlarda bulunan ve yapay ortamda zayıf veya yavaş büyüyen enfeksiyonlar için değerli ve güvenilir bir teşhis yöntemidir.

3.5 İmmünolojik yöntem

İmmünolojik yöntem(serolojik), spesifik antikorları ve antijenleri tanımlamak için kan serumunun yanı sıra diğer biyolojik substratlarla ilgili çalışmaları içerir. Klasik serodiagnoz, tanımlanmış veya şüphelenilen bir patojene karşı antikorların belirlenmesine dayanmaktadır. Pozitif bir reaksiyon sonucu, test edilen kan serumunda patojen antijenlerine karşı antikorların varlığını gösterir; negatif bir sonuç ise bunların bulunmadığını gösterir. İncelenmekte olan kan serumunda bir dizi bulaşıcı hastalığın etken maddesine karşı antikorların tespiti, tanı koymak için yeterli değildir, çünkü enfeksiyon sonrası veya aşılama sonrası bağışıklığın, dolayısıyla "eşleştirilmiş" kanın varlığını yansıtabilir. Serumlar incelenir, ilki hastalığın ilk günlerinde alınır, ikincisi ise 7-10 gün arayla alınır. Bu durumda antikor seviyelerindeki artışın dinamikleri değerlendirilir.

Test kan serumundaki antikor titresinde başlangıç ​​düzeyine göre en az 4 kat artış teşhis açısından anlamlıdır. Bu olaya serokonversiyon denir. Nadir bulaşıcı hastalıkların yanı sıra viral hepatit, HIV enfeksiyonu ve diğer bazı durumlarda antikorların varlığı, hastanın enfekte olduğunu ve tanısal değeri olduğunu gösterir.

Antikor titresinin belirlenmesinin yanı sıra serolojik çalışmalar sırasında antikor izotipinin belirlenmesi de mümkündür. İnsan vücudunun bir patojenle ilk karşılaşmasında akut dönem hastalıklarda IgM'ye ait antikorlarda daha hızlı bir artış ortaya çıkar, bu seviye maksimum değere ulaştıktan sonra azalır. Hastalığın ilerleyen evrelerinde IgG antikorlarının sayısı artar, bu antikorlar daha uzun süre kalıcı olur ve yeniden iyileşme döneminde belirlenir. Patojenle tekrar karşılaşıldığında immünolojik hafıza sayesinde humoral bağışıklık reaksiyonları IgG antikorlarının daha hızlı üretilmesiyle ortaya çıkar ve M sınıfı antikorlar küçük miktarlarda üretilir. IgM antikorlarının tespiti akımın varlığını gösterir bulaşıcı süreç ve IgG antikorlarının varlığı geçmiş bir enfeksiyonu veya aşılama sonrası bağışıklığı gösterir.

Birincil ve ikincil bağışıklık tepkisinin özelliklerini dikkate alarak, IgM ve IgG antikorlarının oranının analizi, bazı durumlarda bulaşıcı sürecin aşamasını (hastalığın yüksekliği, iyileşme, nüksetme) ayırt etmeye olanak tanır. Örneğin viral hepatit A (HA) durumunda güvenilir bir tanı yöntemi kan serumunda anti-HAV IgM antikorlarının belirlenmesidir. Tespitleri mevcut veya yeni HAV enfeksiyonunu gösterir.

Antikorları tespit etmek için serolojik testler bulaşıcı hastalıklar Daha fazla olan erişilebilir yöntem Patojen izolasyonundan ziyade laboratuvar teşhisi. Bazen pozitif bir serolojik reaksiyon, organizmanın ilgili bulaşıcı hastalığın etken maddesi ile karşılaşmasının ve etkileşiminin tek kanıtı olarak hizmet eder. Ayrıca benzer klinik tabloya sahip birçok hastalığın (örneğin riketsiyoz, enterovirüs enfeksiyonları) yalnızca serolojik olarak ayırt edilebilmesi, bulaşıcı hastalıkların tanısında serolojik yöntemlerin önemini yansıtmaktadır.

virüslerin biyolojisini ve bunların tanımlanmasını inceleme yöntemleri. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nüfuz etme yöntemlerini ve viral üreme özelliklerini, viral nükleik asitlerin ve proteinlerin birincil yapısını oluşturmanın mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerinin kurucu elemanlarının dizisini belirlemek için yöntemler geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve kodladıkları proteinlerin fonksiyonlarını nükleotid dizisine bağlamak ve viral enfeksiyonun patogenezinde önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini belirlemek mümkün hale gelir.

Virolojik araştırma yöntemleri aynı zamanda immünolojik süreçlere (antijenin antikorlarla etkileşimi), virüsün biyolojik özelliklerine (hemaglutinasyon yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özelliklerine (sitopatik etkinin doğası) dayanmaktadır. , hücre içi kapanımların oluşumu, vb.) .

Viral enfeksiyonların tanısında, virüslerin yetiştirilmesinde, izolasyonunda ve tanımlanmasında, ayrıca aşı preparatlarının üretiminde doku ve hücre kültürü yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincil, ikincil, stabil sürekli ve diploid hücre kültürleri kullanılır. Birincil kültürler, dokuyu proteolitik enzimler (tripsin, kollajenaz) ile dağıtarak elde edilir. Hücrelerin kaynağı insan ve hayvan embriyolarının doku ve organları (genellikle böbrekler) olabilir. Besin ortamındaki hücrelerin bir süspansiyonu şiltelere, şişelere veya Petri kaplarına yerleştirilir; burada hücreler kabın yüzeyine bağlandıktan sonra çoğalmaya başlar. Virüs enfeksiyonu için genellikle bir hücre tek katmanı kullanılır. Besin sıvısı boşaltılır, belirli seyreltmelerde viral süspansiyon eklenir ve hücrelerle temas ettirildikten sonra genellikle serumsuz taze besin ortamı eklenir.

Birincil kültürlerin çoğunun hücreleri alt kültürlenebilir; böyle bir kültüre ikincil kültür denir. Hücrelerin daha fazla geçişiyle, hızlı çoğalma yeteneğine sahip, çoğu orijinal kromozom setini koruyan fibroblast benzeri hücre popülasyonu oluşur. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri olarak kültürlenmesiyle stabil sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid kromozom setine sahip, hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre çizgileri tek katmanlı veya süspansiyonlu olabilir. Tek katmanlı kültürler cam yüzey üzerinde sürekli bir katman şeklinde büyürken, süspansiyon kültürleri ise karıştırma cihazları kullanılarak çeşitli kaplarda süspansiyonlar şeklinde büyür. 40 farklı hayvan türünden (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlardan elde edilen 400'den fazla hücre dizisi vardır.

Bireysel organ ve doku parçaları (organ kültürleri) yapay besin ortamlarında kültürlenebilir. Bu tür kültürler, özellikle farklılaşmamış doku kültürlerinde çoğalmayan virüslerin (örneğin, koronavirüsler) izolasyonu ve geçişi için önemli olan doku yapısını korur.

Enfekte hücre kültürlerinde virüsler, hücre morfolojisindeki değişikliklerle, spesifik olabilen sitopatik etkilerle, inklüzyonların ortaya çıkmasıyla, hücrede ve kültür sıvısında viral antijenlerin belirlenmesiyle tespit edilebilir; kültür sıvısındaki viral nesillerin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve doku kültüründe, tavuk embriyolarında veya hassas hayvanlarda virüslerin titre edilmesi; Hücrelerdeki bireysel viral nükleik asitlerin moleküler hibridizasyon yoluyla veya nükleik asit birikimlerinin floresan mikroskopi kullanılarak sitokimyasal yöntemle tanımlanması yoluyla.

Virüsleri izole etmek emek yoğun ve zaman alıcı bir süreçtir. Popülasyon arasında dolaşan virüsün tipini veya varyantını belirlemek için gerçekleştirilir (örneğin, grip virüsünün bir serovaryantını, çocuk felci virüsünün yabani veya aşı suşunu vb. tanımlamak için); acil epidemiyolojik önlemlerin alınmasının gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya çeşitleri ortaya çıktığında; gerekirse ön tanıyı onaylayın; çevresel nesnelerdeki virüslerin tespiti için. Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalma olasılıklarının yanı sıra iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun meydana gelme olasılığı dikkate alınır. Bir viriondan elde edilen virüsün genetik olarak homojen popülasyonuna viral klon denir ve bunu elde etme sürecine klonlama denir.

Virüsleri izole etmek için duyarlı laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu ve tavuk embriyoları kullanılır, ancak çoğunlukla doku kültürü kullanılır. Bir virüsün varlığı genellikle spesifik hücre dejenerasyonu (sitopatik etki), semplast ve sinsit oluşumu, hücre içi kapanımların tespiti ve ayrıca immünofloresan, hemadsorpsiyon, hemaglutinasyon (hemaglutinasyon virüsleri için) vb. kullanılarak tespit edilen spesifik bir antijen ile belirlenir. . Bu belirtiler ancak virüsün 2-3 geçişinden sonra tespit edilebiliyor.

İnfluenza virüsleri gibi bir dizi virüsü izole etmek için tavuk embriyoları kullanılır ve bazı Coxsackie virüslerini ve bir dizi arbovirüsü izole etmek için yeni doğmuş fareler kullanılır. İzole edilmiş virüslerin tanımlanması serolojik reaksiyonlar ve diğer yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir.

Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüslerin titrasyonu genellikle doku kültüründe gerçekleştirilir; doku dejenerasyonunun meydana geldiği virüs içeren sıvının en yüksek seyreltmesi belirlenir, kalıntılar ve virüse özgü antijenler oluşturulur. Plak yöntemi birçok virüsün titre edilmesinde kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, agar kaplaması altında tek katmanlı bir doku kültüründe virüs tarafından yok edilen hücrelerin odaklarıdır. Koloni sayımı, bir bulaşıcı virüs parçacığının bir plak oluşturması temelinde virüslerin bulaşıcı aktivitesinin niceliksel bir analizine olanak tanır. Plaklar, kültürün genellikle nötr kırmızı olan intravital boyalarla boyanmasıyla tespit edilir; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planında hafif noktalar olarak görülebilir. Virüs titresi, 1 beher başına plak oluşturan ünite sayısı olarak ifade edilir. ml.

Virüslerin saflaştırılması ve konsantrasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme ve ardından konsantrasyon veya yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile gerçekleştirilir. Virüsleri saflaştırmak için immünolojik yöntemler, iyon değişim kromatografisi, immünosorbentler vb. kullanılır.

Viral enfeksiyonların laboratuvar tanısı, klinik materyalde patojenin veya bileşenlerinin tespitini içerir; virüsün bu materyalden izole edilmesi; serolojik tanı. Her bir vakada laboratuvar teşhis yönteminin seçimi, hastalığın doğasına, hastalığın süresine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Viral enfeksiyonların modern teşhisi, hastalıktan sonraki erken aşamalarda klinik materyal alındıktan birkaç saat sonra cevap almayı mümkün kılan ekspres yöntemlere dayanmaktadır.Bunlar arasında elektron ve immün elektron mikroskobu ve ayrıca moleküler hibridizasyon yöntemi olan immünofloresan bulunur. , IgM sınıfının antikorlarının tespiti vb.

Negatif boyalı virüslerin elektron mikroskobu, virüsleri ayırt etmeyi ve konsantrasyonlarını belirlemeyi mümkün kılar. Viral enfeksiyonların tanısında elektron mikroskobunun kullanımı, klinik materyaldeki viral partikül konsantrasyonunun oldukça yüksek olduğu durumlarla sınırlıdır (10 5'te 1). ml Ve daha yüksek). Yöntemin dezavantajı aynı taksonomik gruba ait virüslerin ayırt edilememesidir. Bu eksiklik immün elektron mikroskobu kullanılarak giderilir. Yöntem, viral partiküllere spesifik serum eklenirken aynı anda viral partiküllerin yoğunlaştırılarak tanımlanmasına olanak tanıyarak bağışıklık komplekslerinin oluşturulmasına dayanıyor. Yöntem aynı zamanda antikorları tespit etmek için de kullanılır. Açık teşhis amacıyla, doku ekstraktlarının, dışkıların, keseciklerden gelen sıvının ve nazofarenks salgılarının elektron mikroskobik incelemesi gerçekleştirilir. Elektron mikroskobu, virüsün morfogenezini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır; etiketli antikorların kullanımıyla yetenekleri genişletilmektedir.

Virüse özgü nükleik asitlerin tespitine dayanan moleküler hibridizasyon yöntemi, genlerin tek kopyalarının tespit edilmesini mümkün kılar ve hassasiyet açısından eşi benzeri yoktur. Reaksiyon, tamamlayıcı DNA veya RNA iplikçiklerinin (problar) hibridizasyonuna ve çift iplikli yapıların oluşumuna dayanır. En ucuz prob klonlanmış rekombinant DNA'dır. Prob, radyoaktif öncüllerle (genellikle radyoaktif fosfor) etiketlenmiştir. Kolorimetrik reaksiyonların kullanımı umut vericidir. Moleküler hibridizasyon için çeşitli seçenekler vardır: spot hibridizasyon, leke hibridizasyon, sandviç hibridizasyon, yerinde hibridizasyon vb.

IgM sınıfı antikorlar, G sınıfı antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3.-5. gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, dolayısıyla bunların tespiti yeni bir enfeksiyona işaret eder. IgM sınıfına ait antikorlar, immünofloresan veya anti-μ antiserum (lgM'nin ağır zincirlerine karşı serum) kullanılarak enzim immünoanalizi ile tespit edilir.

Virolojideki serolojik yöntemler klasik immünolojik reaksiyonlara dayanmaktadır (bkz. İmmünolojik araştırma yöntemleri) : kompleman fiksasyon reaksiyonları, hemaglütinasyon inhibisyonu, biyolojik nötralizasyon, immünodifüzyon, dolaylı hemaglutinasyon, radyal hemoliz, immünfloresan, enzim immünolojik testi, radyoimmünoanaliz. Pek çok reaksiyon için mikro yöntemler geliştirilmiş ve teknikleri sürekli olarak geliştirilmektedir. Bu yöntemler, bilinen bir dizi serum kullanarak virüsleri tanımlamak ve ikinci serumdaki antikorlardaki birinciye kıyasla artışı belirlemek için serodiagnoz için kullanılır (ilk serum hastalıktan sonraki ilk günlerde alınır, ikincisi - 2-2'den sonra). 3 hafta). Tanısal değer, ikinci serumdaki antikorlarda dört kattan az bir artış değildir. IgM sınıfına ait antikorların tespiti yeni bir enfeksiyonu gösteriyorsa, IgC sınıfına ait antikorlar birkaç yıl, bazen de ömür boyu devam eder.

Proteinlerin ön saflaştırılması olmadan karmaşık karışımlarda virüslerin ayrı ayrı antijenlerini ve bunlara karşı antikorları tanımlamak için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak protein fraksiyonasyonunu ve ardından enzim immünoanaliz yöntemini kullanarak proteinlerin immüno-endikasyonunu birleştirir. Protein ayrımı, antijenin kimyasal saflığına ilişkin gereksinimleri azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin tanımlanmasını mümkün kılar. Bu görev, örneğin, yanlış pozitif enzime bağlı immünosorbent tahlil reaksiyonlarının, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak mevcut olan hücresel antijenlere karşı antikorların varlığından kaynaklandığı HIV enfeksiyonunun serodiagnozu ile ilgilidir. Hasta serumlarında iç ve dış viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, hastalığın evresini ve popülasyonları analiz ederken viral proteinlerin değişkenliğini belirlemeyi mümkün kılar. HIV enfeksiyonu için immünoblotlama, bireysel viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tanımlamak için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. Yöntemin büyük değeri, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenlerin analiz edilmesi, boyutlarının ve antijenik belirleyicilerin varlığının belirlenmesi olasılığında yatmaktadır.

Kaynakça: Bukrinskaya A.G. Viroloji, M., 1986; Viroloji, Yöntemler, ed. B. Meikhi, çev. İngilizce'den, M., 1988; Mikrobiyolojik ve virolojik araştırma yöntemleri el kitabı, ed. M.O. Birgera, M., 1982.

• - termofilik aerobik mikroorganizmaların hayati aktivitesinin bir sonucu olarak ısıtılmalarına dayanan, organik maddeler içeren atıkların nötrleştirilmesine yönelik yöntemler...

  Tıp ansiklopedisi

• - doku kesitleri organik maddelerle inkübe edildiğinde enzimatik aktivitenin lokalize olduğu yerlerde kalsiyum veya magnezyum fosfat birikintilerinin oluşumunun reaksiyonuna dayanan enzimleri tanımlamak için histokimyasal yöntemler.

  Tıp ansiklopedisi

• - preparatlardaki histiositleri tanımlama yöntemleri sinir dokusu ve amonyak gümüşü veya gümüşün piridin-soda çözeltileri kullanılarak çeşitli organlar...

  Tıp ansiklopedisi

• - Ailelerde gözlemlenen ve beklenen hasta ve sağlıklı oranlarının karşılaştırılmasına dayanan, mirasın niteliğine ilişkin varsayımları değerlendirme yöntemleri. kalıtsal hastalıklar yöntemi dikkate alarak...

  Tıp ansiklopedisi

• - normal, patolojik ve deneysel koşullarda insan, hayvan ve bitki organizmalarının hücre ve dokularının yapısını ve fonksiyonunu incelemek için kullanılır...

  Tıp ansiklopedisi

• - histolojik bölümlerde kimyasal maddelerin tanımlanmasına yönelik yöntemler. G. m.'nin ayrılmaz bir parçası ve. ortaya çıkaran sitokimyasal yöntemlerdir. kimyasal maddeler hazırlanan smear ve baskı hücrelerinde...

  Tıp ansiklopedisi

• - glikoz oksidaz enziminin varlığında glikozun atmosferik oksijen tarafından oksidasyonuna dayanan, kan ve idrardaki glikozun niceliksel ve niteliksel olarak belirlenmesine yönelik yöntemler.

  Tıp ansiklopedisi

• - teşhis yöntemleri antijenlerin ve antikorların spesifik etkileşimine dayanan çalışmalar...

  Tıp ansiklopedisi

• - lifli yapıların tanımlanmasına yönelik yöntemler bağ dokusu ve histolojik preparasyonlardaki nöroglia, çok renkli renklerine dayanarak...

  Tıp ansiklopedisi

• - 1) bir potasyum şap ve rodamin çözeltisi olan Mayer hemalun kullanılarak dermisin histolojik preparatlarının boyanması yöntemi; hücre çekirdekleri mavi, eleidin - kırmızı renkte boyanır...

  Tıp ansiklopedisi

• - tıpta - tıp ve sağlık hizmetleriyle ilgili nesnelerin ve sistemlerin durumu ve davranışının niceliksel incelenmesi ve analizi için bir dizi yöntem...

  Tıp ansiklopedisi

• - mikroskop kullanarak çeşitli nesneleri incelemenin yolları...

  Tıp ansiklopedisi

• - Maddenin doğası, dağılımı ve etkileşimi ile ilgili optik yasalarının kullanımına dayanmaktadır. Elektromanyetik radyasyon optik aralık...

  Tıp ansiklopedisi

• - duyuları kullanarak çevresel nesnelerin kalitesini incelemek ve değerlendirmek için yöntemler...

  Tıp ansiklopedisi

• - yaygın isim Glial ve diğer arjirofilik lifleri tanımlamak için histolojik preparatları gümüşle emprenye etmeye yönelik bir dizi yöntem...

  Tıp ansiklopedisi

• - suçların soruşturulması ve hukuk davalarının değerlendirilmesi sırasında ortaya çıkan özel sorunları çözmek üzere soruşturmacı ve mahkeme tarafından atanır. Adli tıp doktorlarının önerisiyle de yapılıyor...

  Tıp ansiklopedisi

Kitaplarda "Virolojik araştırma yöntemleri"

Adına Öldüren Makineye Karşı Öfke (1992)

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Los Angeles'lı grup Rage Against The Machine'in ilk albümü hip-hop ve hard rock'ı bir araya getirerek onları güncel politik manifestolarla ve hoş bir şekilde hatırı sayılır dozda yoğun funk ritmiyle tatlandırıyordu. İlk single'da yer alan "Killing in the Name" şarkısında,

James Brown Kalk (A Olmak Gibi Hissediyorum) Seks Makinesi (1970)

James Brown Kalk (A Olmuş Gibi Hissediyorum) Seks Makinesi (1970) 1960'ların sonunda James Brown deneylere başladı. The Famous Flames'ın yürek burkan ruhu, yerini The J.B.'nin şıngırdayan funk'ına bıraktı. Yaklaşan funk döneminin en önemli dönüm noktalarından biri, on dakikalık versiyonuyla karşımıza çıkan "Sex Machine" oldu.

Makineye karşı öfke