ELISA teşhisi: Antikorların özü nedir, belirlenmesi, nasıl yapılır ve hangi hastalıklar için etkilidir? HIV enfeksiyonunu teşhis etmek için modern yöntemler Anti HIV 1 2 ne

RU 2283497 patentinin sahipleri:

Buluş biyoteknoloji ve tıp alanıyla ilgilidir. Birinci ve ikinci tip insan immün yetmezlik virüsüne (HIV), birinci tip grup O'ya karşı antikorların spektrumunu tanımlamak ve birinci tip p24 insan immün yetmezlik virüsüne karşı antijeni tanımlamak için enzim bağlantılı immünosorbent test sistemi, gp41 (env HIV-1 ve HIV-2 grup O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), HIV antijeni 1'e karşı antikorları temsil eden insan immün yetmezlik virüsü antijenlerine dayanan immünosorbent p24 ve saptama reaktifleri, enzim bağlantılı immünosorbent tahlili için plakaların farklı yuvalarına emdirilen yukarıdaki HIV antijenleri ve HIV antikorları ve soğurma için 96 yuvalı polistiren katlanabilir veya ayrılamayan plakalar kullanılır. Buluş, sonuçların değerlendirilmesinde hassasiyetin arttırılmasını, basitleştirilmesini ve subjektifliğin ortadan kaldırılmasını sağlar. 1 maaş dosyalar, 10 tablo, 1 hasta.

Buluş biyoteknoloji ve tıp alanıyla ilgilidir. Kullanım: İnsan immün yetmezlik virüsü proteinleri 1 ve 2, HIV 1 grup O ve HIV 1 p24 antijenine karşı tüm spesifik antikor sınıflarının farklılaştırılmış tespiti.

Öz: kan serumu (plazma), immünoglobulinler ve insan kan ürünlerindeki HIV 1 ve 2, HIV 1 grup O ve HIV 1 p24 antijenine karşı tüm sınıflardaki antikorların spektrumunu tanımlamak için enzim bağlantılı bir immünosorbent test sisteminin elde edilmesi HIV 1 ve 2, HIV 1 grup O'ya karşı antikor spektrumunu tanımlamak, HIV 1 p24 antijeninin saptanması ve HIV 1 ve 2, HIV 1 grup O ve HIV 1 p24 antijenine karşı antikorlar için pozitif veya şüpheli tarama sonuçlarının doğrulanması.

BULUŞUN AÇIKLAMASI

HIV enfeksiyonunun laboratuvar tanısı üç alana dayanmaktadır: a) HIV ve bileşenlerinin endikasyonu; b) HIV'e karşı antikorların tespiti; c) Bağışıklık sistemindeki değişikliklerin belirlenmesi. Arasında mevcut yöntemler laboratuvar teşhisi en yaygın olanları serolojiktir - virüs antijenlerine karşı antikorların tespiti.

HIV enfeksiyonunda antikorları tespit etmek için esas olarak kullanılırlar bağlantılı immünosorbent tahlili(ELISA) ve immünoblotlama (IB). ELISA, viral antijenlerin hastanın antikorlarının bağlandığı plakalar üzerinde immobilizasyonuna dayanır ve antijen-antikor kompleksi, insan immünoglobülinleri G ve M'ye karşı yaban turpu peroksidazı ile konjuge fare monoklonal antikorları kullanılarak tespit edilir. Yöntem oldukça spesifik ve hassastır ve hastaların %95'inde virüse özgü antikorların saptanmasına olanak sağlar. Vakaların geri kalan %5'i, kan serumunda hala çok az antikor bulunduğunda enfeksiyonun erken evrelerinde veya vücudun şiddetli tükenme nedeniyle artık antikor sentezleyemediği hastalığın terminal evrelerinde ortaya çıkar. bağışıklık sistemi. Yanlış pozitif ELISA sonuçları da özellikle otoimmün ve onkolojik hastalıklar Ashtein-Barr virüsünün neden olduğu enfeksiyonun yanı sıra. Bu durumda antikorların romatoid faktöre çapraz reaksiyonu meydana gelir; Epstein Barr Virüsü veya ana doku uyumluluk kompleksi sınıf 1 ve 2'nin (HLA-4 ve DQW3) proteinlerine benzer olan ve HIV antijenlerine bağlanma yeteneğine sahip antijenik determinantlara. Yanlış pozitif sonuçlar hamile kadınlarda ve yaşlılarda yaygındır. Hemoliz, lipemi ve serumun bakteriyel kontaminasyonu da güvenilmez sonuçlara neden olabilir.

Bu bağlamda, antikor tespit sonuçlarının özgüllüğünü test etmek için bir dizi yöntem önerilmiş ve kullanılmıştır. Bu yöntemlerden en sık kullanılanı “Western Blot” modifikasyonunda “immun blot” reaksiyonudur. Yöntemin özü şu şekildedir: İlk aşamada HIV proteinleri, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak moleküler ağırlığa göre ayrılır. Daha sonra poliakrilamid jelden nitroselüloz membranın yüzeyine elektroforetik transfer gerçekleştirilir. Bu şekilde aktarılan antijenler, dolaylı analiz kullanılarak membran üzerinde tespit edilir: membran, test materyali ile inkübe edilir; içerilen antikorlar nitroselüloz membrana aktarılan HIV antijenlerine bağlanır, daha sonra membran şeritleri konjugat ile inkübe edilir; Bir antijen-antikor kompleksi oluştuğunda, konjugat ona bağlanır; konjugattan yıkandıktan ve substrat ile inkübasyondan sonra, antijen-antikor-konjugat kompleksi oluşumunun meydana geldiği nitroselüloz alanlarında boyama meydana gelir. Çizimde pozitif, zayıf pozitif ve negatif immünoblot sonuçlarının örnekleri gösterilmektedir.

HIV-1 ve HIV-2 ile enfekte kişilerin serumunda aşağıdaki proteinlere (p) ve glikoproteinlere (gp) karşı antikorlar tespit edilmiştir: Tablo A.

Tablo B, DSÖ ve Rusya AIDS Önleme ve Kontrol Merkezi tarafından önerilen immünoblotlama sonuçlarının değerlendirilmesine yönelik kriterleri sunmaktadır.

WHO kriterlerine göre, herhangi iki HIV-1 zarf proteinine karşı antikorların IB yöntemiyle tespit edildiği serumlar pozitif kabul edilir. Zarf proteinlerinden yalnızca biriyle (gp160, gp120, gp41) diğer proteinlerle kombinasyon halinde veya reaksiyon olmadan reaksiyon varsa sonuç şüpheli kabul edilir. Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı'nın AIDS'in Önlenmesi ve Kontrolü Federal Bilimsel ve Metodoloji Merkezi'ne göre, yalnızca bir membran proteinine karşı antikorların varlığında bile serumları pozitif olarak yorumlamak mümkündür.

p24 antijenine karşı antikorların saptanması serokonversiyonun başlangıç ​​periyodunu gösterebilir, çünkü bu proteine ​​karşı antikorlar ilk önce ortaya çıkar. Env proteinleriyle reaksiyon olmadan gag ve pol proteinleriyle pozitif reaksiyonlar, erken serokonversiyon aşamasını yansıtabilir ve ayrıca HIV-2 enfeksiyonunun veya spesifik olmayan bir reaksiyonun varlığına işaret edebilir.

HIV tanısı için uzman bir yöntem olarak immünoblotlama reaksiyonunun kullanılmasının bir takım önemli dezavantajları vardır:

1. HIV'e karşı antijen ve antikorları aynı anda tespit eden testlerin kullanılması durumunda HIV p24 antijeni 1'in tespitinin doğrulanmasının imkansızlığı, bu da HIV'e karşı antijen ve antikorların eşzamanlı tespiti için tarama testlerinin kullanılmasını uygunsuz (anlamsız) hale getirir ( Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı'nın 30 Temmuz 2001 tarih ve 292 sayılı Emri: “kan nakil istasyonlarındaki bağışçıları incelemek için, HIV'e karşı antijen ve antikorları aynı anda tespit eden test sistemlerinin kullanılması gerekmektedir”).

2. Yalnızca IgG sınıfına ait antikorların tespiti. 3. ve 4. nesil testler (IgG ve IgM antikorlarını tespit eden) kullanılarak elde edilen pozitif sonuçların tam olarak doğrulanması mümkün değildir.

3. Özellikle “şüpheli” ve “belirsiz” sonuçlar olması durumunda test puanlarının yorumlanmasında öznellik ve Ilk aşamalar serokonversiyon (bu vakalarda nitroselüloz membranlarda tespit edilen bantlar net değildir, çıplak gözle zar zor görülebilir ve farklı kişiler tarafından değerlendirildiğinde sıklıkla anlaşmazlıklar ortaya çıkar).

4. Analiz sonuçlarının otomatik niceliksel değerlendirmesinin imkansızlığı.

5. ELISA'ya kıyasla daha düşük hassasiyet.

6. Kısa raf ömrü (depolama sırasında nitroselüloz membran şeritleri solar ve tartışmalı vakalarda HIV'in saptanıp saptanmadığının objektif bir onayı olamaz).

7. Reaksiyonun kurulması ve saklanması zorluğu (nitroselüloz membran şeritleri çok kırılgandır ve sıklıkla kırılır).

8. Bilgi güvenliği kitlerinin yüksek maliyeti.

Bilinen bir reaktif, HIV dahil aynı patojene karşı antijenlerin ve antikorların eşzamanlı belirlenmesine yönelik bir kittir (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Ancak HIV enfeksiyonunun çeşitli aşamalarda teşhis edilmesine olanak tanıyan bir test sistemi açıklanmamıştır.

Mevcut buluşun amacı, eş zamanlı tespit için testler kullanıldığında HIV 1 ve 2, HIV 1 grup O ve HIV 1 p24 antijenine karşı antikorlara yönelik tarama testlerinin pozitif veya şüpheli sonuçlarını doğrulamanın mümkün olduğu bir test sistemi elde etmektir. antijenler ve antikorlar.

Önerilen teknik çözüm, birinci ve ikinci tip insan immün yetmezlik virüsüne (HIV), birinci grup O tipine ve insan immün yetmezlik p24 antijenine karşı antikorların spektrumunu tanımlamak için enzim bağlantılı bir immünosorban test sistemi ile elde edilir. birinci tip p24 virüsü, özelliği gp41 (env HIV-1 ve HIV-2 grup O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol)'u temsil eden insan immün yetmezlik virüsü antijenlerine dayalı bir immünosorbent içermesidir. , gp36 (env HIV-2), HIV 1 antijeni p24'e karşı antikorlar ve tespit reaktifleri bulunurken, yukarıda bahsedilen HIV antijenleri ve HIV antikorları, enzim bağlantılı immünosorbent tahlil plakalarının farklı yuvalarına adsorbe edilir.

Ek olarak, sorpsiyon için enzim immünolojik tahlili için 96 gözlü polistiren katlanabilir veya sökülemez plakalar kullanılır.

Mevcut buluşla elde edilen teknik sonuç, HIV 1 ve 2, HIV 1 grup O ve HIV 1 p24 antijenine karşı antikorlar için pozitif sonuçların doğrulanması olasılığı, yüksek hassasiyet, sonuçların otomatik olarak yorumlanma olasılığı olup, bu da testin subjektifliğini ortadan kaldırır. değerlendirme, testi gerçekleştirme kolaylığı, mevcut maliyet bilgi güvenliği setlerine göre daha azdır.

Bu teknik çözüm bilinenlerden farklıdır:

1. Katı faz taşıyıcısı olarak immünolojik reaksiyonlar için bir plakanın kullanılması.

2. HIV p 24'e karşı antikorların ve bir sorbent olarak bir dizi HIV antijeninin eşzamanlı kullanımı.

Buluş aşağıdaki örnekle açıklanmaktadır.

Geliştirilen "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" test sisteminin aktif prensipleri şunlardır:

İmmünosorbent - HIV-1'in yapısal proteinlerine benzer rekombinant antijenler: gp41 (env HIV-1 ve HIV 1 grup O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) ve polistiren katlanabilir plakanın şeritleri üzerine ayrı ayrı adsorbe edilen HIV 1(p24) antijenine karşı monoklonal fare antikorları.

İmmünosorbent kullanımını hazırlamak için:

1. HIV-1 gp41, E. Coli suşu No. AHIV 103 tarafından üretilen bir proteindir.

2. HIV-1 gp120, E. Coli suşu No. AHIV 109 tarafından üretilen bir proteindir.

3. HIV-1 p24, E. Coli suşu No. AHIV 105 tarafından üretilen bir proteindir.

4. HIV-1 p31, E. Coli suşu No. AHIV 108 tarafından üretilen bir proteindir.

5. HIV-2 p36, E. Coli suşu No. AHIV 106 tarafından üretilen bir proteindir.

Liyofilize veya sıvı Konjugat 1, biyotin ile konjuge edilmiş HIV1 p24 antijenine yönelik bir fare monoklonal antikorudur.

1. Liyofilize veya sıvı Konjugat 2, HIV-1'in yapısal proteinlerine benzer rekombinant antijenlerin bir karışımıdır: gp41 (env HIV-1 ve HIV 1 grup O), gp120 (env), p24 (gag), p31( po1); HIV-2: biyotine konjuge gp36 (env);

2. Yaban turpu peroksidazı ile etiketlenmiş konjugatlar 3, 4 - liyofilize veya sıvı - streptavidin;

Ön çalışmalar sırasında test sisteminin tasarımı seçildi, bileşenlerini hazırlama teknolojisi geliştirildi ve enzim immünolojik test reaksiyonunu yürütme koşulları optimize edildi.

"DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1" test sisteminde ELISA yapılırken, p24'e emdirilmiş antikorlarla plakanın oyuklarına 25 ul konjugat-1 eklenir ve 25 ul Sorbe edilmiş antijenlerin bulunduğu kuyucuklara konjugat-1 eklenir, 25 µl konjugat-2. Reaksiyon şeması aşağıda gösterilmiştir. Daha sonra her kuyucuğa 25 ul test numunesi eklenir. Aynı zamanda, antijenli kuyucuklarda renk turuncudan pembeye, antikorlu kuyucuklarda ise yeşilden griye değişir. Karışım, bir çalkalayıcı üzerinde 37°C'de 45 dakika (veya bir termostatta 37°C'de 1 saat) inkübe edilir. Daha sonra yıkamadan, p24 antijenini belirlemek için plakanın kuyucuklarına 50 µl konjugat-3 ve antikorları belirlemek için kuyucuklara 50 µl konjugat-4 ekleyin. Bir çalkalayıcı üzerinde 37°C'de 20 dakika (veya bir termostatta 37°C'de 30 dakika) inkübasyondan sonra plaka yıkanır ve bir substrat karışımı ile geliştirilir. Toplam reaksiyon süresi 1 saat 25 dakika (veya 1 saat 50 dakika). Test örneğinde bulunan p24 antijeni, p24'e yönelik monoklonal antikorlara bağlanır ve spesifik antikorlar, plaka üzerinde rekombinant antijenlerle bir kompleks oluşturur. Ortaya çıkan anti-p24 ile p24'ün bağışıklık kompleksi, anti-p24-biyotin konjugatları, ardından streptavidin-peroksidaz ile tespit edilir ve At-HIV ile Ag-HIV immün kompleksleri, bir Ag-biyotin konjugatı, ardından streptavidin- ile tespit edilir. peroksidaz.

Reaksiyonun kurulum şeması.

Sonuçlar, cihaz "hava yoluyla" yapılandırıldığında 450/620-680 nm olmak üzere iki dalga boyunda spektrofotometrik olarak dikkate alınır. 450 nm'lik bir dalga boyundaki sonuçları dikkate alalım.

K-'li kuyucuklardaki ortalama optik yoğunluk (OD) değerleri 0,2'den fazla değilse, K+'lı kuyucuklarda - 1,0'dan az değilse, analiz sonuçları dikkate alınır. OP kritik. formülle hesaplanır:

OP kritik. gp41 = ortalama. Anlam OP K-(gp41)+0.15

OP kritik. gp120 = ortalama. Anlam OP K-(gp120)+0.15

OP kritik. p24 = ortalama. Anlam OP K-(р24)+0.15

OP kritik. p31 = ortalama. Anlam OP K-(р31)+0.15

OP kritik. gp36 = ortalama. Anlam OP K-(gp36)+0.15

OP kritik. Ag p24 = ort. Anlam OP k- (Ag p24)+0,04

burada 0,15 ve 0,04, imalatçıda istatistiksel işlemlerle belirlenen katsayılardır. Test sisteminin geliştirilmesi sırasında aşağıdakiler kullanıldı:

1. Sağlıklı donörlerden alınan kan serumu örnekleri (n=610).

2. HIV ile ilişkili olmayan çeşitli bulaşıcı hastalıkları (akut solunum yolu enfeksiyonları, zatürre, bademcik iltihabı, herpetik ve sitomegalovirüs enfeksiyonu, frengi, klamidya, viral hepatit A, B ve C (n=224)).

3. Çeşitli hastalardan alınan kan serumu örnekleri bulaşıcı Olmayan Hastalıklar- yaralanmalar, hastalıklar kardiyovasküler sistemin, onkoloji (n=35).

4. Gebe kadınlardan alınan kan serumu örnekleri (n=40).

5. ELISA'da seropozitif olan ve immünoblotta doğrulanan kan serumu örnekleri (n=428).

6. HIV 1.2 antikorları ve p24 antijeninin eş zamanlı tespiti için enzim immünolojik test sistemlerinde pozitif sonuç veren ve immünoblot ile belirsiz sonuç veren serum numuneleri (n=123).

7. HIV 1,2'ye karşı antikor içeren ve içermeyen, enzim immünolojik test sistemleri ve Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı tarafından tescilli immünoblot ile test edilen serumlardan oluşan dahili panel (n=21).

8. Standart "HIV 1 ANTİJEN STANDARDI", "BIO RAD", Fransa, kat. No. 72217, viral lizattan elde edilen bir antijendir.

9. İşletmenin iç standardı. Viral lizattan elde edilen ve "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" şirketi "BIO RAD", Fransa, kat. 72217 numara.

10. İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü tip 1'e (HIV 1) karşı antikorlar içeren standart serum paneli - OSO 42-28-212-93-02P, "Medical and Biological Union", Novosibirsk.

11. İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü tip 2'ye (HIV 2) karşı antikorlar içeren serumların standart paneli - OSO-42-28-216-02P, "Medical and Biological Union", Novosibirsk.

12. İnsan immün yetmezlik virüsü tip 1 ve 2'ye (HIV 1, 2) karşı antikorlar içermeyen standart serum paneli - OSO-42-28-214-94-02P, "Medical and Biological Union", Novosibirsk.

Test sisteminin p24 antijenini tespit etme hassasiyeti, "HIV I ANTİJEN STANDARDI", "BIO RAD" ve kuruluşun Dahili Standardı kullanılarak değerlendirildi. Dahili Standart kullanılarak, seyreltici olarak HIV antikorları 1, 2 içermeyen normal donör plazması ile 40 pg/ml'den 5 pg/ml'ye kadar 4 seri 2 kat seyreltme hazırlandı. En az miktar tespit edilen antijen duyarlılık kriteri olarak alındı. Elde edilen veriler Tablo 1'de sunulmaktadır.

Spesifik antikorların saptanmasında test sisteminin hassasiyetini değerlendirmek için insan immün yetmezlik virüsüne (HIV 1, 2) karşı antikorlar içeren standart numune panelleri kullanıldı (OSO 42-28-212-93-02P s.012, OSO 42- 28-216-02P (HIV 2) s.003).

Elde edilen veriler tablo 3, 4'te sunulmaktadır.

"DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" test sisteminin tanısal etkinliği "Jenskrin-HIV-Ag/At" (Bio-Rad), "DIA-HIV" test sistemleriyle karşılaştırıldı 1/2" (Diaprof-Med), "Vironostika HIV Uni-form II Ag/At" (Biomerioux), "Rekombinant-HIV1,2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1,2 K" (Amercard) ), "HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). Bu amaçla dahili panelden alınan serum numuneleri belirlenen tüm testlerde test edilmiştir. Tablo 5'te sunulan sonuçlar, "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1"in yüksek teşhis etkinliğini göstermektedir.

"DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" test sisteminin duyarlılık çalışmaları, immünoblotlamayla HIV pozitif olduğu doğrulanan hastaların kan serumlarıyla da gerçekleştirildi. Bu tür serumların toplam 428 örneği test edildi. Farklı HIV proteinlerine ve p24 antijenine karşı antikorların saptanması için çeşitli seçenekler elde edilmiştir. Sonuçlar Tablo 6'da sunulmaktadır.

HIV 1 pozitif örnekleri test ederken serumların %3'ü şunu gösterdi: olumlu tepki gp36 (HIV env 2) ile. OP/OPcrit. bu örneklerde 2,0'ı aşmadı. HIV 1 (gp41) ve HIV 2'nin (gp36) dış kabuk proteinlerinin çapraz reaktivitesine ilişkin verilerimiz literatür verileriyle örtüşmektedir.

Sonuçların yorumlanması

"DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1"de HIV pozitif serumların ve standart ve dahili panellerden alınan numunelerin testinin analizi, bu testin sonuçlarını yorumlamak için kriterler geliştirmemize olanak sağladı. Önerilen kriterler Tablo 7'de verilmiştir.

Bu kriterlere göre HIV pozitif serum örneklerinin tamamının (n=428) “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1” testinde pozitif olduğu belirlendi. HIV 1'e karşı antikor içeren standart panelin 16 örneğinden 14'ünün pozitif, 2'sinin ise belirsiz olduğu belirlendi. HIV 2'ye karşı antikorlar içeren standart panelden alınan 8 örneğin tamamının pozitif olduğu belirlendi. HIV 1'e karşı antikor içeren iç paneldeki 10 numuneden 7'sinin pozitif, 3'ünün ise belirsiz olduğu belirlendi.

Antikorları ve eş zamanlı olarak antikorları tespit eden enzim bağlantılı immünosorbent test sistemlerinde pozitif sonuç veren hastaların kan serumları ile "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" test sisteminin duyarlılık çalışmaları da yapıldı. p24 antijeni ve immünoblotta belirsiz. Bu tür toplam 123 numune test edildi. Veriler Tablo 8'de sunulmaktadır.

“DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1”de belirsiz immünoblot sonucu (n=123) olan serumlar test edilirken 72 örnek (%58,5) pozitif sonuç gösterdi. Bunlardan 26 serum (%21,1) yalnızca p24 için pozitifti, 20'si (%16,3) - yalnızca antikorlar için, 16'sı (%13) - proteinlerden birine karşı antikorlarla p24 için, 10'u (%8,1) - p24 üzerinde iki veya daha fazla proteine ​​karşı antikorlar. Bu nedenle, yalnızca antikorlar için test yapılması (p24 tespit edilmeden), 30 örneğin (%24,4) pozitif olarak tanımlanmasını sağlayacaktır. Testte p24 antijeninin saptanması, ilave 42 numunenin (%34,1) pozitif olarak tanımlanmasına olanak sağladı.

Test sisteminin özgüllüğünü değerlendirmek için HIV 1, 2'ye (n=20) karşı antikor içermeyen standart bir serum paneli kullanıldı; sağlıklı donörlerden alınan kan serumu örnekleri (n=610), HIV ile ilişkili olmayan çeşitli enfeksiyon hastalıkları olan hastalardan alınan kan serumu örnekleri (n=224); çeşitli bulaşıcı olmayan hastalıkları (travma, kardiyovasküler sistem hastalıkları, onkoloji) olan hastalardan alınan kan serumu örnekleri (n=35); hamile kadınlardan alınan kan serumu örnekleri (n=40). Toplam 929 örnek test edildi. Sağlıklı donörlerin kan serumlarından alınan bir örnek yanlış pozitif sonuç gösterdi; gp41 ve p24'e karşı antikorlar tespit edildi. Sağlıklı donörlerden alınan 7 kan serumu örneği ve HIV ile ilişkili olmayan bulaşıcı hastalıkları olan hastalardan alınan 2 kan serumu örneği, p24 için yanlış pozitif sonuç gösterdi.

Test sisteminin özgüllüğünü değerlendirmek için standart bir negatif örnek paneli kullanıldı (OSO 42-28-214-94-02p, s. 009). Spesifiklik %100 idi.

Böylece yapılan çalışmalar, normal donörlerden ve çeşitli bulaşıcı ve somatik hastalıkları olan hastalardan alınan kan serumu örneklerini incelerken “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” test sisteminin özgüllüğünün %99 olduğunu göstermiştir. .

Elde edilen veriler, geliştirilen "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" test sisteminin yüksek teşhis etkinliğini göstermektedir. Test sistemi, antikorları tespit eden test sistemleriyle veya antikorları ve HIV1 p24 antijenini aynı anda tespit eden test sistemleriyle pozitif bir tarama sonucunu doğrulamak amacıyla HIV tip 1 ve 2'nin ayrı ayrı proteinlerine ve HIV1 p24 antijenine karşı antikorları tespit etmek için kullanılabilir. Test sistemi, pozitif sonuçları doğrulamanın yanı sıra HIV antikorlarının ve p24 antijeninin dinamiklerini incelemek için alternatif bir immünoblot testi olarak kullanılabilir. Farklı aşamalar enfeksiyonlar.

TESTİN AVANTAJLARI

1. Tablet formatında doğrulayıcı enzim immünolojik testi

2. HIV 1, 2 antikor spektrumu ve HIV 1 p24 antijeninin belirlenmesini birleştiren doğrulayıcı test

3. Tüm Ig sınıflarına ait antikorların tespiti

4. p24'ü tespit etme hassasiyeti en az 5 pg/ml'dir

5. İmmünoblotlamaya kıyasla belirsiz sonuçları azaltır

6. Analiz süresi - 1 saat 25 dakika (immunoblot - 3 ila 20 saat arası)

7. Tüm bileşenlerin ve örneklerin eklenmesinin görsel değerlendirmesi.

1. Birinci ve ikinci tip insan immün yetmezlik virüsüne (HIV), birinci tip grup O'ya karşı antikorların spektrumunu tanımlamak ve birinci tip insan immün yetmezlik virüsüne karşı p24 antijenini tanımlamak için enzim bağlantılı bir immünosorban test sistemi p24, gp41 (env HIV-1 ve HIV-2 grup O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV)'i temsil eden, insan immün yetmezlik virüsü antijenlerine dayanan bir immünosorbent içermesiyle karakterize edilir -2), HIV 1 antijeni p24'e karşı antikorlar ve tespit reaktifleri bulunurken, yukarıda bahsedilen HIV antijenleri ve HIV antikorları, enzime bağlı immünosorbent tahlili için plakaların farklı yuvalarına emilir.

2. İstem 1'e göre enzim bağışıklık tahlili test sistemi olup, bu sistemin özelliği, emme için enzim bağışıklık tahlili için 96-yuvalı polistiren çökebilir ya da ayrılamaz plakaların kullanılmasıdır.

Çalışmaya ilişkin genel bilgiler

HIV (insan bağışıklık yetersizliği virüsü), insan bağışıklık sisteminin hücrelerini (CD4, T yardımcı hücreleri) enfekte eden retrovirüs ailesinden bir virüstür. AIDS'e neden olur.

HIV-1 en yaygın virüs türüdür ve en sık Rusya, ABD, Avrupa, Japonya ve Avustralya'da bulunur (genellikle alt tip B).

HIV-2, Batı Afrika'da yaygın olan nadir bir türdür.

İnsan bağışıklık yetersizliği virüsünü teşhis etmek için, HIV enfeksiyonunu virüsün kana girmesinden sonraki 2 hafta içinde tespit edebilen dördüncü nesil kombine test sistemi kullanılırken, birinci nesil test sistemleri bunu enfeksiyondan yalnızca 6-12 hafta sonra yapıyor.

Bu kombine HIV testinin avantajı, HIV-1 p24'e karşı antikorların reaktif olarak kullanılması sayesinde, spesifik p24 antijeninin (viral kapsid proteini) saptanmasıdır; bu, bu testle, testin başlangıcından itibaren 1-4 hafta içinde tespit edilebilir. enfeksiyon anı, yani serokonversiyondan önce bile, bu da “pencere periyodunu” önemli ölçüde kısaltır.

Ayrıca bu HIV testi, enfeksiyondan 2-8 hafta sonra test sistemi tarafından tespit edilmeye yetecek miktarda üretilen kandaki HIV-1 ve HIV-2 antikorlarını (antijen-antikor reaksiyonunu kullanarak) tespit eder.

Serokonversiyondan sonra antikorlar p24 antijenine bağlanmaya başlar, bu da pozitif HIV antikor testi ve negatif p24 testiyle sonuçlanır. Ancak bir süre sonra kanda hem antikor hem de antijen aynı anda tespit edilecektir. Açık son aşama HIV'e karşı antikorlar için bir AIDS testi, antikor üretme mekanizması bozulduğu için negatif sonuç verebilir.

HIV enfeksiyonunun aşamaları

1. Kuluçka dönemi veya "seronegatif pencere dönemi", enfeksiyon anından, HIV antikor testlerinin negatif olduğu ancak kişinin virüsü zaten bulaştırabildiği kanda virüse karşı koruyucu antikorların gelişmesine kadar geçen süredir. diğer insanlara. Bu sürenin süresi 2 haftadan 6 aya kadardır.
2. Akut dönem HIV enfeksiyonu enfeksiyon anından itibaren ortalama 2-4 hafta içinde ortaya çıkar ve yaklaşık 2-3 hafta sürer. Bu aşamada bazı kişilerde virüsün aktif çoğalması nedeniyle spesifik olmayan grip benzeri semptomlar gelişebilir.
3. Gizli aşama asemptomatiktir, ancak bu sırada bağışıklıkta kademeli bir azalma ve kandaki virüs miktarında bir artış olur.
4. AIDS (edinilmiş immün yetmezlik sendromu), bağışıklık sisteminin ciddi şekilde baskılanmasının yanı sıra eşlik eden hastalıklar, ensefalopati veya kanserle karakterize edilen HIV enfeksiyonunun gelişiminin son aşamasıdır.

HIV enfeksiyonunun tedavi edilemez olmasına rağmen, bugün HIV ile enfekte bir kişinin ömrünü önemli ölçüde uzatabilen ve kalitesini artırabilen oldukça aktif antiretroviral tedavi (ART) bulunmaktadır.

HIV enfeksiyonu test zamanından kısa bir süre önce (2-4 hafta) meydana gelmişse, bu testin özellikle yüksek tanısal değeri vardır.

Araştırma ne için kullanılıyor?

Analiz şunun için kullanılır: erken tanı HIV, virüsün diğer insanlara daha fazla bulaşmasını önlemenin yanı sıra, antiretroviral tedaviye ve HIV enfeksiyonunun ilerlemesine katkıda bulunan hastalıkların tedavisine derhal başlamanıza olanak tanır.

Çalışma ne zaman planlanıyor?

• Etiyolojisi bilinmeyen kalıcı semptomlarla (2-3 hafta boyunca): düşük dereceli ateş ishal, gece terlemeleri ani kilo kaybı, genişlemiş lenf düğümleri.
• Tekrarlayanlar için herpetik enfeksiyon, viral hepatit, zatürre, tüberküloz, toksoplazmoz.
• Hasta cinsel yolla bulaşan hastalıklardan (sifiliz, klamidya, bel soğukluğu, genital herpes, bakteriyel vajinoz) muzdaripse.
• Hasta birden fazla cinsel partnerle, yeni bir partnerle veya hastanın HIV durumundan emin olmadığı bir partnerle korunmasız vajinal, anal veya oral seks yaptıysa.
• Hastaya donörden kan transfüzyonu yapıldığında (her ne kadar bu şekilde enfeksiyon vakaları pratik olarak hariç tutulsa da, kan viral partiküllerin varlığı açısından dikkatlice test edildiğinden ve özel ısıl işleme tabi tutulduğundan).
• Hastanın steril olmayan aletler kullanarak ilaç enjekte etmesi durumunda.
• Hamilelik sırasında/hamileliği planlarken (hamilelik sırasında azidotimidin alınması, Sezaryen bölümü geçerken virüsün çocuğa bulaşmasını önlemek için doğum kanalı emzirmemek anneden çocuğa HIV bulaşma riskini %30'dan %1'e düşürür.
• içeren bir şırınga veya başka bir nesnenin (örneğin tıbbi bir alet) kazara enjeksiyonu enfekte kan(bu gibi durumlarda enfeksiyon olasılığı son derece düşüktür).

Bu rapor, hastaların da dahil olduğu 40.823 kişinin kan serumunda HIV antikorlarının belirlenmesinin sonuçlarını sunmaktadır. doğum öncesi klinikleri klinikler, şehir hastaneleri ve risk altındaki hastaların (uyuşturucu bağımlıları, uyuşturucu bağımlısı hastalar) muayene ve tedavisi konusunda uzmanlaşmış tıp merkezleri viral hepatit B, C ve zührevi hastalıklar). Çalışmalar 2005 yılında Adını taşıyan Kadın Hastalıkları ve Doğum Araştırma Enstitüsü'nün immünoloji laboratuvarında gerçekleştirildi. ÖNCE. Çeşitli hastalıkların teşhisi için ELISA yöntemlerini kullanma konusunda 15 yıldan fazla deneyime sahip olan Ott RAMS bulaşıcı hastalıklar.

Kan serumu örneklerinin ilk incelemesi için, HIV-1 ve HIV-1'e karşı toplam spesifik antikorları tespit eden "CombiBest anti-HIV-1+2" test sistemini (ZAO "Vector-Best", Novosibirsk) kullandık. incelenen insan serumu veya plazması örnekleri 2 (immünoglobulin sınıfları A, G ve M). Bu teşhis kitinde, rekombinant HIV proteinleri hem plakaların oyuklarında immobilizasyon için hem de yaban turpu peroksidazı ile konjugat formunda kullanılmaktadır. Serum analizinin sonuçları, test sistemi talimatlarının tavsiyelerine uygun olarak değerlendirildi: test edilen numuneler, ELISA'da optik yoğunluğu (OD) olan negatif olarak kabul edildi (HIV-1 ve HIV-2'ye karşı antikorlar içermiyor). OPcrit değerini aşmadı.

Laboratuvarda yapılan taramada 40.823 serum örneğinin 40.222'sinde (%98,5) negatif ELISA sonucu elde edildi ve test edilen örneklerin 601'i (%1,5) başlangıçta pozitif kabul edildi. Ertesi gün 601 serumun her birinin çift kopya halinde (plakanın iki kuyucuğu) tekrarlanan analizi sonucunda 440 (%73,2) örneğin pozitif, 161 (%26,8) örneğin negatif olduğu belirlendi. Sağlık ve Sosyal Kalkınma Bakanlığı'nın tavsiyeleri doğrultusunda 440 tarama pozitif serum donduruldu ve ek doğrulama çalışmaları için adını taşıyan 30 numaralı hastanenin referans laboratuvarının danışma ve teşhis ofisine aktarıldı. S.P. Botkina. Bu çalışmalar “EKOlab-Vironostika HIV 1.2 Ag/Ab” (“EKOlab”, Elektrogorsk), “Genscreen Plus” enzim immünolojik test sistemleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HIV Ag-Ab” (“BioRad”, ABD) ve ayrıca immünoblotlama kitleri. Doğrulayıcı testlerde 440 serumun analizi sonucunda 323 (%73,4) numunenin pozitif, 102 (%23,2) numunenin negatif olduğu sonucuna varıldı. Test edilen 15 numune için (%3,4) belirsiz bir analitik sonuç elde edildi.

Bu 323 pozitif serumun 314'ü (%97,2) için CombiBest anti-HIV-1+2 test sistemi kullanılarak yapılan ilk testler sırasında laboratuvarımızda elde edilen OD değerlerinin 0,900 ile 1,780 arasında değiştiği ve 9'u için de dikkate alınması gerekir. (%2,8) örnekler – 0,500–0,900. 52 örnek (%51) için 102 negatif serumun taranmasından elde edilen OD değerleri 0,195 ile 0,400 arasında değişiyordu; 40 (%39,2) örnek için – 0,401–0,800; 10 (%9,8) örnek – 0,800'den fazla.

Böylece, yapılan çalışma sonucunda, CombiBest anti-HIV-1+2 test sistemi kullanılarak kan serumunda HIV enfeksiyonunun serolojik belirteçlerinin varlığı açısından yapılan ilk incelemenin oldukça etkili olduğu gösterilmiştir. Pozitif tarama sonuçları, vakaların %73'ünde referans laboratuvarında yapılan ek testlerle doğrulandı ve analiz edilen 40.823 serumun yalnızca %0,25'i için yanlış pozitif sonuçlar kaydedildi.

Bugün dünyada en yaygın olanı AIDS- retrovirüslerin alt ailesinden bir virüs, bunlara lentivirüsler veya "yavaş" da denir. Nitekim insan vücudunda nispeten uzun bir süre, yaklaşık 10 yıl sonra faaliyet göstermeye başlarlar.

Birinci ve ikinci tipte immün yetmezlikler vardır. Ancak birinci tip virüsün yayılımından rahatlıkla bahsedebiliriz. Virüs kana karışıp bağışıklıktan sorumlu hücreye katıldığında hızla çoğalmaya başlıyor. Tanınmasından sorumlu CD4 molekülü tanımlarken hain düşman tüm vücuda bulaşmayı başarıyor. Bu nedenle teşhis ne kadar erken konursa hastanın zamanında tedavi alma şansı da o kadar artar. tedavi ve daha uzun yaşa.

Bir kişinin kendine AIDS testi yaptırmak için bir nedeni varsa, bu hemen yapılmalıdır. Çoğu zaman, bu tür bir teşhisin temeli, kandaki immün yetmezliğe karşı antikorların belirlenmesidir - virüsün varlığına tepki olarak ortaya çıkan proteinler ve olası zamandan itibaren 1,5 ila 6 ay arasında oluşmaya başlarlar. enfeksiyon. Buna göre bu dönemden sonra teşhis yapılması daha tavsiye edilir.

Antikorların miktarı, enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) adı verilen bir analiz kullanılarak belirlenir. Bu yöntem güvenilirdir, nispeten doğrudur ve oldukça hassastır, bu rakamlar %99,5'in üzerindedir. İlaç pazarı ELISA için bir dizi teşhis test kiti sunmaktadır: CombiBest HIV, Anti-HIV 1 2, CombiBest anti-HIV, CombiBest anti-HIV 1 2, CombiBest anti-HIV 1 2 d 0172. Bu test sistemleri üçüncü gruba aittir. nesil. Bu reaktiflerin dezavantajı: Hastalığı her zaman tespit edememeleridir. erken tarihler. Kişi zaten bir virüs taşıyıcısıdır, partnerler için potansiyel olarak tehlikelidir, ancak kanda henüz antikorlar mevcut değildir.

Kitler esas olarak 12*8 veya 192 anti-HIV testini yürütmek için bir dizi testle donatılmıştır. Bunları kendi başınıza kullanmanız önerilmez. İlaçların açıklaması, asıl amaçlarının her iki AIDS türüne karşı antikor miktarını tespit etmek olduğunu göstermektedir. Ayrıca tüm sınıfların AIDS'e karşı antikorlarını da belirler. Antikor yoksa hastalık teşhis edilmemiş demektir.

Dördüncü nesil testler, antikorlara ek olarak AIDS antijenlerini de “görür”; enfeksiyonu üçüncü nesil yöntemlere göre daha erken tespit edebilirler. Karşılaştırma için: HIV antijeni 5. günden itibaren kanda bulunur ve ilk antikorlar en geç bir ay sonra ortaya çıkar. CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (set 1) ve CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (set 2) 4. nesil testlere aittir. Bu reaktiflerden oluşan bir set kullanılarak tip 1, 2 ve p24 antijenine karşı antikorlar, insan kan serumu veya plazması incelenerek tespit edilir. Birçok ülke Antijen/Antikor olarak da adlandırılan, AGAT olarak kısaltılan 4. nesil ELISA testini kullanmaktadır.

Test anonim olarak gerçekleştirilir.